203198. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immungátló, monokin-, különösen interleukin-1-gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 198 B 2 A lizátumot úgy állítottuk elő, hogy a mosott emberi monocitákból álló egysejt-réteghez 0,01% digilonint tartalmazó 0,3 ml vizet adtunk 1.4.bAzIL-l szintézisére és felszabadulására kifejtett hatás 50 pl homogenizátumot a közeggel 500 pl-re hígítottunk majd összeolvadó porcsejtekhez adtuk, hogy a fém-proteináz-indukáló hatást - amely az IL-1 tartalom mértéke - ellenőrizzük Az IL-1 -tartalmat meghatároztuk továbbá a tenyésztőközegben, valamint a sejt-homogenizátumokban és sejt-lizátumokban radioimmun-méréssel (a következőkben: RIA-méréssel) (lásd a fenti 1.3. pontot). E vizsgálat során a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - különösen a D2 jelű vegyület - jelentősen csökkentették az IL-1 szintjét a felülúszó közegben, míg a sejt-homogenizátumokban és sejt-lizátumokban jelenlévő DL-1-tartalom csak kevéssé csökkent vagy változatlan maradt. \J5.A monociták tapadására gyakorolt hatás Frissen gyűjtött, emberi egymagvú sejtekből a vizsgálandó vegyület vagy vivőanyag jelenlétében monocitákat különítettünk el, majd 4 óra elmúltával a közeget leszívtuk és az egysejt-réteget szokás szerint mostuk Ezt követően a tapadó monocitákat vizes digiton in-oldattal lizáltuk és meghatároztuk a DNS menynyiségét, valamint az LDH citoszol enzim-aktivitását. E vizsgálat során a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - különösen a D2 jelű vegyület - és a vivőanyag nem csökkentették a monociták tapadóképességét. 1.6.A monokinok elválasztására kifejtett hatás Az IL-l-en TNF-a-n és IL-6-on kívül két jól megkülönböztethető monokin létezik amelyek stimulált monocitákból szabadulnak fel. A fentebb leírt módon emberi monocitákból tenyésztőközeget állítottunk elő, és a fentebb leírt RIA- méréssel meghatároztuk az IL-1 és TNF-a-tartalmat, valamint az alábbiakban leírt biológiai vizsgálattal meghatároztuk az IL-ó-tartalmat. E vizsgálat során a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - különösen a D2 jelű vegyület - az IL-1 felszabadulását jelentősebb mértékben gátolták, mint az IL-6 és TNF-a felszabadulását. Az IL-6 biológiai meghatározása: Az emberi monocitákból származó IL-6 kondicionált közegekben történő mérése céljából 0,2 ml térfogatú, mülüiterenként 2,4 x 104 B 13.29 sejtet tartalmazó közeget 96-üreges lemezeken tenyésztettünk 48 órán át olyan tenyésztőközeggel, amelyet 200 E/ml rekombináns IL-6-tal, 50 pM 2-merkapto-etanollal és antibiotikumokkal kiegészített, szérummentes, Iscove szerint módosított Dulbecco-közeggel hígítottunk. A burjánzás mértékét az utolsó 6 órában alkalmazott 3H-timidin (üregenként lpC) beépülésével határoztuk meg. A beépült radioaktivitást tartalmazó terméket szűrőpapírra gyűjtöttük, aktivitását meghatároztuk, és standard IL-6 készítményhez viszonyítottuk. 1 .7. A laktát-dehidrogenáz szivárgására és a lizozim elválasztására gyakorolt hatás A fentebb leírtak szerint emberi monocitákból tenyésztő-közeget állítottunk elő. A lizozimet és a laktát-dehidrogenázt (a továbbiakban) LDH) kinetikusán ellenőriztük egy személyi számítógéppel összekapcsolt Twinreader műszerrel (gyártója a Flow Laboratories AG cég). 50 pl térfogatú mintákat az LDH meghatározása céljából 200 pl szuszbsztrátum-keverékkel elegyítettünk, amely végkoncentrációban 50 mM foszfát-puffért (pH 7,5), 0,8 mM nátrium-piruvátot, 0,24 mM NADH2 -t és 0,04% szarvasmarha-albumint tartalmazott, és egyperces időközökben 11-szer mértük az abszorbancia változását 340 nm hullámhoszszon. A számítógép megadta azokat a kezdeti sebességeket, amelyeket az egységek meghatározásához használtunk. A lizozim meghatározása céljából 50 pl térfogatú mintákat 100 pl olyan szuszpenzióval elegyítettünk, amely mülüiterenként 1,2 mg M. lysodeikticus-t, valamint 67 mM koncentrációban foszfát-puffért (pH 6,2) tartalmazott, majd 4-perces időközökben 11-szer mértük a zavarosság változását 492 nm hullámhosszon. Minden egyes mérési sorozathoz kalibrációs görbét készítettünk kristályos tyúktojás-fehérje lizozim alkalmazásával [J. Exp. Med. 148, 435 (1978)1. Sem a kontroüból, sem a kezelt sejttenyészetekből végbemenő jelentős LDH-szivárgást nem figyeltünk meg. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - különösen a D2 jelű vegyület - csupán elhanyagolható mértékben csökkentették a lizozim felszabadulását, és ez a csökkenés nem esett a nem stimulált kontrollok szintje alá. 2. A csonfelszrvódás megelőzése (a szöveti kalcium-kiürülés kezelése) 4-5 napos Swiss albino egerek koponyacsontjának frontális és parietális részét (felezett koponyatetőcsont) rozsdamentes acélhálón BGJ csontszöveti tenyésztőközegben tenyésztettünk, amelyet a közeg közbenső fázisában 1 mg/ml BSA-val és a nedves atmoszférában gázzal (95% levegő és 5% szén-dioxid keveréke) egészítettünk ki. A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten végeztük [lásd a következő helyen: Reynolds és munkatársai: „Organ Culture in Biomedical Research”, kiadók: Balls és Mamichendam, Cambridge University Press, 355-366. old; (1987)]. Meghatároztuk a vizsgálandó anyag különböző koncentrációinak befolyását a vizsgálati közegbe történő kalcium-felszabadulásra a kalcium-felszabadulást serkentő anyagok [PGE2, LPS és 1,25-dihidro- D3-vitamin] jelenlétében. Ebből a célból megmértük a kalcium-koncentrációkat olyan csonttenyészet-felülúszókban, amelyeket 72- és 144-órás tenyészetekből nyertünk, valamint mértük a kalcium-koncentrációkat a koponyacsontok TCA-kivonataiban a tenyésztés végén spektrofotometriás módszerrel [Am. J. Clin. Pathol. 58,376 (1972)]. Meghatároztuk továbbá az N-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
