203131. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új 1,12-dihidroxi-1,6,12,17-tetraaza-di-ciklodokozán-2,5,13,16-tetron és az ezt a vegyületet hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 131 B 2 goknak rákos sejtekkel szemben kifejtett citolitikus aktivitását és gátolja a rákos sejtek osztódását. A találmányt közelebbről a kővetkező kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani. 1. példa 10 liter, 7,2 pH-jú, 2% tintahalat és 1% szárított szardíniát (Eugraulis japonica) - mindkettőt őrölt formában - tartalmazó és készeresére hígított mesterséges tengervízzel (a Jamarin Laboratory Inc. japán cég által Jamarin S márkanév alatt forgalmazott termék) készült táptalajjal beoltunk az Alteromonas haloplanktis SB- 1123 (FERM BP-1360) törzzsel. A tenyészetet ezután rázatás közben 3 napon át 27 'C-on inkubáljuk. A tenyészetet ezt követően centrifugáljuk, majd a felülúszóból 7 litert átbocsátunk 500 ml Diaion HP-20 gyantával (a Mitsubishi Kaséi Ltd. tokiói cég gyártja) töltött oszlopon. Az oszlopot 5 liter vízzel mossuk, majd aceton és víz 50:50 térfogatarányú elegyével eluáljuk, 2 literes aktív frakciókat szedve. Az egyesített aktív frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük, a nyers kristályok kicsapása céljából. A kristályokat acetonnal, majd etil-acetáttal mossuk, amikor is a Bisucaberin kristályait kapjuk 2 g mennyiségben. Ha a kristályok barna színűek annak következtében, hogy szennyeződést tertalmaznak, könnyen átalakíthatók színtelen, lemezszerű tiszta kristályokká a következőképpen: szilikagéllel töltött oszlopon kromatografálásnak vetjük a kristályokat alá, eluálószerként kloroform és metanol 96:4 térfogatarányú elegyét használva. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, majd bepároljuk, amikor is tiszta Bisucaberin-t kapunk. 2. példa Ebben a példában a Bisucaberin-nek a makrofágok által rákos sejtekre kifejtett citolitikus aktivitás vonatkozásában mutatott hatását vizsgáljuk. Peritoneális exudátumban található sejtekből makrofágokat nyerünk azáltal, hogy 8 hetes nőstény egereknek (C3H/HeN törzs) 10%-os proteosz-peptont (a Difco cég terméke) intraperitoneálisan injektálunk, majd a műanyaghoz nem tapadó sejteket elkülönítjük. Kísérleti rákos sejtként fibroszarcoma L-1023 sejteket (a National Institute of Health tokiói kutatóintézetből, Dr. Tokunaga, T. kutatótól kaptuk) használunk, amelyeket az említett törzshöz tartozó egerekben metil-kolantrén beadása útján váltunk ki, majd ezeket a sejteket előzetesen jelezzük triciált timidinnel. A sejtek tenyésztését RPMI 1640 jelzésű táptalajon (a GIBCO Life Technologies Inc., Grand Island, New York állam, Amerikai Egyesült Államok, terméke) 37 °C-on 5% szén-dioxid jelenlétében végezzük. 96 lyukú mikrolemez lyukaiba lyukanként 2*105 sejtet mérünk be a makrofágokból és 1-102 * 4 sejtet mérünk be a kísérleti rákos sejtekből, majd előre meghatározott mennyiségű Bisucaberin jelenlétében 2 napon át inkubálást végzünk. Ezután mérjük a lízist szenvedett rákos sejtekből felszabaduló tríciumnak a táptalaj felülúszójából átjutó mennyiségét. A kapott eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. A citolitikus aktivitást a következő egyenlet alapján kiszámított %-os citolízisként adjuk meg: %-os citolízis - [(a kísérleti feszabadulás mennyisége) - (a spontán felszabadulás mennyisége)] / [(a maximális felszabadulás mennyisége) - (a spontán felszabadulás mennyisége)], mely egyenletben a (spontán felszabadulás menynyisége) az az érték, amelyet akkor kapunk, amikor nem adunk mintát a tenyészethez, és (a maximális felszabadulás mennyisége) az az érték, amelyet akkor kapunk, amikor a makrofágok helyett 0,5% SDS-t adagolunk. 1. táblázat Beadagolt Százalékos citolízis Bisucaberin + Makrofágok (%) - Makrofágok (%) mennyisége (pg/ml, végső koncentráció) 67 38,6 41,5 15,3 33 64,8 71,8 12,0 11 45,7 47,1 6,5 3,6 13,3 14,8 0,3 1,2 2,8--0 0-0 3. példa Vizsgáljuk a Bisucaberin-nek egereknél a leukémia L-1210 sejtek és az IMC karcinóma sejtek (saját tenyésztésünk) növekedésének gátlásában kifejtett hatását. A kísérleti körülmények a következők: (1) Tumorsejtek: a) L-1210: 10% borjú szérumot tartalmazó MEM-táptalajon egyszeri passzázzsal tenyésztett b) IMC-karcinóma: 10% boíjúembrió szérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajon végzett passzázzsal tenyésztett. A kísérleteket megelőző napon kezdett tenyésztés során az exponenciális fázist elért tumorsejteket használjuk fel a kísérletek során. (2) Minta: Bisucaberin-t feloldunk dimetil-szulfoxidban, amelynek térfogatát úgy választjuk meg, hogy a végső oldat térfogatának 10%-át adja. Az oldathoz 5 pl mennyiségben Tween 80 márkanevű felületaktív anyagot adunk, majd MÉM táptalajjal (a korábban említett GEBCO cég terméke) a hatóanyag koncentrációját 2 mg/ml-re állítjuk be. Ezt a törzsoldatot hígítjuk azután sorozatban hat fokozatban az említett táptalajjal, minden egyes esetben négyszeres hígítási arányt alkalmazva. (3) Módszer a) 96 lyukú mikrolemezbe lyukanként a mintaoldatból 10 pl-t töltünk, minden egyes kísérleti körülmény esetében 3-3 lyukat hasznosítva. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
