203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 kazaminsavakkal, de nem tartalmaz L-valint, L-izoleucint és L-leucint, lásd alább) kiegészített M9 táptalajban növesztjük. Nagy sejtsűrűségig való felnövesztés után a sejteket M9 táptalajjal mossuk, és ultrahangos kezeléssel fehér, tejszerű diszperzióvá alakított, 1% toluolt tartalmazó, hideg M9 táptalajban feszuszpendáljuk. A sejt-puffertoluol szuszpenziót 40 percen át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy a sejteket permeábilissá tegyük. A permeábilissá tett sejteket ezután M9 táptalajjal mossuk, végül az M9 táptalaj eredeti térfogatának 1/5-ében felszuszpendáljuk. Az egyes vizsgálatokhoz a fenti szuszpenzióból 180-180 pl-t használunk fel. A 300 pl térfogatú reakcióelegy toluollal kezelt sejteket, 0,4 mmól tiamin-pirofoszfátot (TPP), 0,11 mmól koenzim A-t (CoA), 0,68 mmól nikotin-amid-adenindinukleotidot (NAD), 2,6 mmól ditio-treitolt (DTT), 4,1 mmól magnézium-kloridot, 60 mmól 7,5-es pH-jú trisz-hidrogén-kloridot és 6000 cpm, mikrocurie/mikromól [1 *C-1 ]-a-keto-izokapronsavat tartalmaz. A beütésszám mérési hatékonysága 73%. A reakciót olyan 15 ml-es szcintillációs üvegadényben végezzük, melynek csavaros tetejébe egy kétszer 2 cm méretű Whatman 4 szűrőpapírt szorítunk. A 30 pl 1 mólos Hyamine Hydroxide-dal (a metil-benzetónium-hidroxid 1 mólos metanolos oldata, a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178 terméke) átitatott szűrőpapír megköti a reakcióban felszabaduló 14C02-t. 2 órás inkubáció után a szűrőpapírokat 10 ml Beckman Aquasol II (Universal LSC - folyadékszcintilláció-számláló, a New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118 terméke) oldatba merítjük, és a radioaktivitást ebben az oldószerben való 4 órás, vagy még hosszabb ekvilibrálás után, folyadékszcintilláció-számlálóval mérjük. A „vak” kontroll- reakció (amely sejteket nem tartalmaz), körülbelül 50-300 cpm aktivitást eredményez. Az 1-3 törzsnél és ez ehhez hasonló mutánsoknál a „vak” kontroli-reakcióénál kisebb, vagy azzal azonos beütésszámot, míg a szülői törzsnél a „vak” kontroliénál néhányszor nagyobb beütésszámot kapunk. A S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs HL-026 (ATCC 53568) variánsának izolálása A S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs sejtjeit Nutrient-agar táptalaj-lemezekre csíkozva szélesztjük. A viszonylag nagy gyakorisággal megjelenő spontán variánsok közül néhány nem fejleszt légmicéliumot 4 napos, 30 °C hőmérsékleten végzett inkubáció után. Néhány ilyen variánst izolálunk, és ciklopentán- karbonsavval kiegészíetett AP-5 táptalajban fermentálva vizsgáljuk, hogy a variánsok képesek-e nem-természetes avermektinek termelésére. Az izolátumok sorából, melyek közül több nem-természetes avermektineket igen, természetes avermektineket azonban nem termel, egy, a lombik-kísérletekben a szülői S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzsnél több aveimektint termelő törzset a HL-026 (ATCC 53568) azonosító számmal jelölünk. A S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) elágazó láncú 2-oxosav-dehiderogenáz- és elágazó láncú aminosav-transzamináz-hiányos törzs előállítása 1) SAMM agar táptalaj-lemezeken 4 napon át növesztett, körülbelül 100 mg tömegű S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) sejtekkel oltunk 300 ml térfogatú lombikban levő 50 ml SCM táptalajt (pH-7,2). A lombikot ezután 200-as percenkénti fordulatszámmal, 30 °C hőmérsékleten, 24 órán át rázatjuk (az inkubálás végén a pH-8,2). 2) A lombikot a rázógépről levéve, a tenyészet 10 ml-ét steril centrifugacsőben, 5 percen át 2000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. Ezután a sejteket 50 ml SCM táptalajban, 300 ml térfogatú steril Erlenmeyer lombikokban szuszpendáljuk, a lombikokat pedig 2 órán át, 30 °C hőmérsékleten, kör mentén mozgó rázógépen rázatjuk. 3) A szuszpenzió 10 ml-ét steril csőbe mérjük át. 4) 250 pl etil-metán-szulfonátot adunk a szuszpenzióhoz (jól szellőztetett fülkében), alaposan összekeverjük, majd steril, 300 ml térfogatú lombikba töltjük, és a lombikot 3 órán át, 30 °C hőmérsékleten, körmentén mozgó rázógépjen rázatjuk. 5) 40 ml friss, steril SCM táptalajt adunk a lombikhoz, és a rázatást tovább folytatjuk, összesen 70 órán át, 30 °C hőmérsékleten. 6) A lombimkot levéve, annak tartalmát 8000 fodulat/pjerc sebességgel, 10 percen át 20 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A sejteket SCM táptalajban szuszpendálva mossuk, újra lecentrifugáljuk, majd 10 ml SCM táptalajban újra szuszpjendáljuk. 7) Körülbelül 150 telep/táptalaj-lemez sejtkoncentrációban replikázva megvizsgáljuk, hogy az így nyert sejtek képjesek-e L-leucin, L-izoleucin, L-valin, illetve ezek bármilyen kombinációjának jelenlétében, illetve hiányában, M9/glükóz minimál táptalaj-lemezeken növekedni. A találmány szerinti eljárás szempontjából jelentőséggel bíró mutáns sejtek csak az L-leucinnal, L- izoleucinnal és L-valinnal kiegészített táptalajon növekednek. Ezek az elágazó láncú aminosavtranszamináz-aktivitással nem rendelkező S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzsek az L-leucin, L-izoleucin és L-valin előanyagként szolgáló háromféle 2-oxosav (2-oxo-izokapronsav, 2-oxo-3-metil-valeriánsav és 2- oxo-izovaleiránsav) közül eggyel vagy többel kiegészített táptalajon sem növekednek. Ez a viselkedés ellentétes az ilyen táptalajon jól növekedő S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs viselkedésével. A fentiek szerint tehát egyetlen transzamináz-enzim katalizálja az említett 2-oxosavak transzaminációját. SCM táptalaj élesztő autolizátum 10 g/1 marhahús-kivonat 5 g/1 enzimatikus hidrolizált kazein 10 g/1 1 mólos magnézium-szulfát-oldat 3 g/1 1 mólos dikálium-hidrogén-foszfát-oldat, pH-7,0 (sósavval beállítva) 100 g/1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60, 10
