203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU SAMM agar táptalaj dinátrium-hidrogén-foszfát 6,0 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát 3,0 g/1 nátrium-klorid 0,5 g/1 1 mólos magnézium-szulfát 1,0 g/1 0,1 mólos kalcium-klorid-oldat 1.0 g/1 ammónium-klorid 1,0 g/1 dextróz 8,0 g/1 kazaminsav 20,0 g/1 agar 20,0 g/1. A „Syncasa - bcaa" összetétele: 100-szoros töménységű törzsoldat g/1 L-alanin 3,0 L-arginin 4,0 L-aszparaginsav 6,0 L-cisztein 1,0 L-glutaminsav 20,0 glicin 1,0 L-hisztidin 2,0 L-lizin 3,0 L-metionin 3,0 L-fenilalanin 6,0 L-prolin 10,0 L-szerin 6,0 L-treonin 4,0 L-tirozin 4,0 L-triptofán 1,0. Az elegy pH-ját 7-re állítjuk be, majd szűrve sterilezzük az elegyet. A szokásos koncentrációban használva, 1 térfogat törzsoldatot adunk 99 térfogat táptalajhoz. A S. avermitilis JC-923 (ATCC 53669) törzs előállítása a spektinomicin-rezisztens S. avermitilis ATCC 31272 törzs és a S. avermitilis PGS 119 (ATCC 53670) törzs protoplaszjainak fúziójával A spektinomicin-rezisztens S. avermitilis ATCC 31272 a S. avermitilis ATCC 31272 törzs spontán mutánsa. Ezt a mutánst az 50 (ig/ml spektinomicint tartalmazó AS-1 agar táptalajon széleszett ATCC 31272 törzs vegetatív micéliumainak populációjából izoláljuk. A mutáns spórák gazdag táptalajon 50 pg/ml spektinomicinnal szemben rezisztensek, ellentétben az izogénikus szülői törzzsel, amely ilyen feltételek mellett nem növekszik Ezt a domináns, szelektálható genetikai markert sikeresen alkalmazhatjuk elágazó szénláncú aminosav- transzamináz-hiányos ATCC 31272 izolátumok előállítására. AS-1 agar táptalaj (Szilárd halmazállapotú táptalaj Streptomyces-ekhez) élesztőkivonat 1 g L-alain 0,2 g L-arginin 0,2 g 130 B 2 L-aszparagin 0,5 g oldódó keményítő 5,0 g nátrium-klorid 25,0 g dinátrium-szulfát 10,0 g agar 20,0 g desztillált víz 1 1. Az oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be, majd 15 percen át 121 "C hőmérsékleten, autoklávban sterillezzük. 30- 35 ml-t öntünk steril, műanyag Petri-csészékbe (100- szor 15 mm). Eljárások életképes protoplasztok előállítására Streptomyces avermitilis törzsek sejtjeiből A. Az oltóanyagként használható spórák előállítása 1) Spóraszuszpenziókat készítünk a standard eljárások szerint, a szuszpenzió hígításait germinációs agar táptalajra szélesztve meghatározzuk az életképes spórák számát, és a szuszpenzió alikvotjait -70 'C hőmérsékleten, 40% glicerin jelenlétében fagyasztva tároljuk. 2) Felhasználás előtt a tárolt spórákat 1000 g-en 10 percen át centrifugáljuk, majd azonos mennyiségű, 0,85%-os só-oldatban felszuszpendáljuk. 3) Körülbelül 107 spórával oltunk 300 ml térfogatú, 3- vagy 4-rétegű dugóval lezárt lombikban levő 30 ml, 0,5% glicinnel kiegészített, módosított élesztőkivonatmalátakivonat (YEME) folyékony halmazállapotú táptalajt. B. Az oltóanyagként használható, fagyasztott, ultrahanggal kezelt micéliumok előállítása 1) A 600 nm hullámhosszon mért 2-9 turbiditási érték eléréséig növesztjük a PGS-119 törzs micéliális tenyészeteit, Trypticase Soy Broth (TSB) folyékony táptalajban. A tenyészetet üveg szövethomogenizátorral 10-szer homogenizáljuk. 2) A homogenizált micéliumokat TSB-vel kétszeresére hígítjuk, és 20 ml steril polipropilén centrifugacsőbe mérünk. Ultrahang szondát merítünk 1-2 cm mélységben a folyadékba, és a mintát 50%- os erősséggel, 10 másodpercen át ultrahanggal besugározzuk. Az ultrahang-besugárzás egy- vagy kétsejtes egységekre tördeli szét a micélium-tömeget, ezért átoltás után gyors exponenciális növekedés következik be. 3) Az ultrahanggal kezelt micélium-készítményt 40% glicerin- végkoncentráció eléréséig hígítjuk, megfelelő üvegekbe pipettázzuk, és -70 “C hőmérsékleten fagyasztva tároljuk. 4) A YEME táptalaj beoltásához (melyet a fenti A. 3) pont szerint végzünk) szükség szerint, szobahőmérsékleten melegítjük fel az alikvotokat. C. Az oltóanyagként használható, agar táptalajon nőtt telepek előállítása 1) Hat jól fejlett TSA vagy YPD-2 agar táptalajon nőtt PGS-119 telepet oltókaccsal mikrocentrifuga-csőben levő, 200 pl steril vízbe szuszpendálunk. Az YPD- 2 táptalaj összetétele: 10 g/1 Difco élesztőextraktum, 10 g/1 Bacto pepton (Difco), 5 g/1 dextróz, 2 g/1 nát-203 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
