203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 A vegyületeket inszekticidként, vagy a mezőgazdasági kártevők ellen az általános mezőgazdasági gyakorlatnak megfelelően permet, por, emulzió alakjában, vagy más hasonló módon alkalmazzuk. A S. avermitilis 1-3 (ATCC-53567), elágazó szénláncú 2-oxosav-dehidrogenáz-hiányos törzs eló’állítása 1) A S. avermitilis ATCC 31272 törzset egybefolyó baktériumtenyészet New Patch agar táptalajon, 12 napon át, 30 °C hőmérsékleten növesztjük. A táptalaj öszszetétele a kővetekző: V-8 Juice-oldat* 200 ml kalcium-karbonát 3 g agar 1000 ml-ig víz 15 g Nutrient broth táptalaj 1,0 gA nátriumacetát»3H20 1,4 g/1 izovaleriánsav 50 mg/1 izobutirilsav 50 mg/1 2-metil-butirilsav 50 mg/1 izoleucin 250 mg/1 leucin 250 mg/1 valin 250 mg/1 nyomelem-oldat** 1 ml/1. * - 8 növényi kivonat (paradicsom, sárgarépa, zeller, cukorrépa, petrezselyem, fejes saláta, zsázsa és paraj kivonatai), valamint só, aszkorbinsav, citromsav és természetes aromák keveréke. A Campbell Soup Company, Camden, NJ. terméke. ** - A nyomelem-oldat összetétele: vas-klorid*6H20 2,7 g mangán-szulfát*H20 4,2 g réz-szulfát*5H20 0,5 g kalcium-klorid 11,0 g bórsav 0,62 g kobalt-klorid*6H20 0,24 g cink-klorid 0,68 g dinátrium-molibdenát 0,24 g. Ezeket az összetevőket 1 1 0,1 sósavban oldjuk fel. A spórákat három ilyen agarlemzről összegyűjtjük, és 20 ml 0,05 mólos trisz-maleinsav-pufferban (pH-9,0) szuszpendáljuk. 2) 10 ml spóraszuszpenziót mérünk 10 mg N-metil-N’-nitro-N-nitrozó-guanidint (NTG) tartalmazó üvegedénybe. A szuszpenziót 28 °C hőmérsékleten, 60 percen át inkubáljuk és rázatjuk, majd a spórákat 1%os nátrium-klorid-oldattal bőségesen mossuk. 3) A mosás után a spórákat 1%-os nátrium-kloridoldatban szuszpendáljuk, és azonos térfogatú, 80%-os etilén-glikolt keverünk hozzájuk. Ezt a szuszpenziót -20 °C hőmérsékleten tároljuk, és a mutánsok keresésekor a vizsgálandó sejtek forrásaként használjuk. A spórázás megindulása után a spóraszuszpenzióból körülbelül 104 telep fejlődik ki ml-enként. A tárolt spóraszuszpenziót YPD agarlemezekre szélesztjük úgy, hogy agarlemezenként körülbelül 100 telepet kapjunk. (Az YDP táptalaj mind élesztőkivonatból, mind Bacto pepton*-ból, mind glükózból 10 g/l-t, Bacto agar*-ból pedig 15 g/l-t tartalmaz. A táptalaj pH-ját 6,9-re állítjuk sterilezés előtt.) A *-gal jelölt táptalaj-összetevők a Difoo Laboratories, Detroit, Michigan 48238 termékei. 4) 28 °C hőmérsékleten, 2-3 héten át növesztjük a tenyészeteket, majd független telepeket emelünk le az agarlemezekről.és egy szabványos 96 lyukú mikrotiter-Iemez egyes kamráiba helyezzük azokat. A telepeket egy-egy kis darabját párhuzamosan friss agar táptalajokra szélesztjük, hogy a mutánsok azonosítása után életképes sejtek forrásául használhassuk fel azokat. 5) Valamennyi lyukhoz körülbelül 75 pl, 1% glükózt, 0,1% kazaminsavat, 0,01% izovaleriánsavat, 0,01% izobutilrilsavat és 0,01% 2-metil-biturilsavat tartalmazó, folyékony M9 jelű táptalajt adunk. Néhány napig 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk a sejteket, majd vizsgáljuk elágazó szénláncú 2-oxosav-dehidrogenáz aktivitásukat. (Az M9 táptalaj 1-enként 6 g dinátriumhidrogén- foszfátot, 3 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 g nátrium-kloridot és 1 g ammőnium-kloridot tartalmaz. A táptalajt sterilezzük, majd 1 ml steril 1 mólos magnézium-szulfát-oldatot és 1 ml 0,1 mólos kalciumklorid-oldatot adunk hozzá steril körülmények között.) 6) Az M9 táptalajhoz 5% toluolt adtunk, és a nem elegyedő keverékből rövid ultrahang-kezeléssel mikroszuszpenziót állítunk elő. A szuszpenzió 25 ml-éhez 1,2 ml, 2,5 pcurie/ml-es, illetve 10,0 pcurie/mikromólos [14C-l]-2- oxo-izokapronsav-oldatot adunk. A vizsgálandó telepeket tartalmazó mikrotiter-lemezek valamennyi lyukához 50 p.l-t mérünk ebből az elegyből. 7) Az egyes lyukakban termelt uCC>2-t a Tabor és munkatársai: Egyszerű módszer 14C02 kimutatására nagyszámú mintából, valamint a módszer alkalmazása mutánsok gyors szűrésére című közleményében [J. Bacteriol., 128, 485-486. (1976)] leírt módszer alapján megkötjük és láthatóvá tesszük. Az elágazó láncú 2- oxosav-dehidrogenázzal nem rendelkező mutánsok nem termelnek több jelzett bárium-karbonátot, mint amennyi a kontrolioknál megfigyelhető. Egy, a ,4C02 termelésének vizsgálata során a pozitív és a negatív mérés, azaz a jelzett bárium-karbonát-keletkezés eredményeként az autoradiogramon létrejött sötét folt és a hiányzó, vagy a nagyon halvány folt kontrasztját növelő, finomított módszer kivitelezésekor a következő módosított szűrést alkalmazzuk. Az egyedi telepeket (lásd a fenti 4) pontot) 7-14 nap növekedés után emeljük le az agar táptalajról (2-3 hetes növekedés helyett), és közvetlenül a fenti, 6) és 7) pont szerint eljárva vizsgáljuk azokat. A fenti eljárás 5) pontját kihagyjuk. Egy még tovább finomított, a UC02 felszabadulása szempontjából kvantitatív jellegű vizsgálati módszer szerint a fenti szűréssel kimutatott mutánsokat megfelelő, 1% glükózzal és 0,1% „Syncasa-bcaa”-val (L- aminosavak szintetikus keveréke, összetétele közelítőleg emgegyezik a kereskedelmi forgalomban kapható 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
