203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 sav, glutaminsav vágj’ metionin- maradék, azaz -CH(COOH)CH2COOH, -CH(COOH)(CH2)2COOH vagy -CH(COOH)(CH2)2 SCH3-csoport. A csak elágazó láncú aminosav-transzamináz-hiányos S. avermitilis törzseknél a 2-oxosavak szintén előanyagul szolgálnak. így a fenti S. avermitilis törzseknél az avermektinek bioszintézisében az alábbi általános képlett! savak is hasznosulhatnak: R-CO-Z, ahol R és Z a fenti meghatározások szerinti csoport. A találmány szerinti eljárás kivitelezésekor levegőztetett körülmények között fermentálunk az elágazó láncú 2-oxosav- dehidrogenáz-aktivitással, és/vagy elágazó láncú aminosav- traszamináz-aktivitással nem rendelkező S. avermitilis törzzsel, felhasználható nitrogén- és szénforrást, szervetlen sókat, valamint az RCOOH általános képlett! vegvületeket, vagy az ilyen vegyületekké a fermentáció során általakulni képes vegyületeket (előanyagokat) tartalmazó, vizes táptalajban. A savat vagy a savvá általakítható vegyületet akár a beoltáskor, akár a fermentáció során bizonyos időközönként adhatjuk hozzá a fermentléhez. A transzamináz-negatív mutánsokat használva, a táptalajnak L- izoleucint, L-leucint és L-valint is tartalmaznia kell, hogy a mutáns növekedhessen. Az avermektinek termelését a fermentléből vett minták szerves oldószerrel való extrahálása után, például nagynyomású folyadékkromatográfia alkalmazásával, a terméknek a kromatogramon való megjelenése alapján ellenőrizhetjük. Az inkubációt addig folytatjuk, míg a maximális termelést el nem érjük; ez általában 4-tól 15 napig terjedő időszakot jelent. A primer vegyület (karbonsavak, illetve a karbonsavakká alakítható vegyületek) előnyös mennyisége valamennyi adagoláskor 0,05 és 3,0 gramm/liter között van. A primer vegyületet akár folyamatosan, akár szakaszosan, akár egyszerre adhatjuk a fermentléhez. A savat (RCOOH) akár savként, akár nátrium-, lítiumvagy ammónium-sóként, akár a fentiek szerint meghatározott, savvá átalakuló vegyületként adagoljuk. Amennyiben a sav szilárd anyag, célszerű" megfelelő oldószerben, például vízben, vagy 1-4 szénatmos alkoholban feloldani. A fermentációhoz használt táptalaj, különösen, ha C-25- szubsztituensként izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoportot várunk, felhasználható szén-, nitrogén- és nyomelem-forrást tartalmazó, szokásos táptalaj lehet. Ha C-25-szubsztituensként nem-természetes csoportot, vagyis nem izopropil-vagy (S)-szek- butil-csoportot választunk, akkor a fermentációs táptalajhoz kiválasztott összetevők nem, vagy csak minimális mennyiségben tartalmazhatják azokat a primer vegyületeket, ahol R izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoport. Néhány napos, 24-33 °C hőmérsékleten végzett fermentáció után a ferment levet centrifugáljuk vagy szűrjük, a micéliumot pedig előnyösen acetonnal vagy metanollal extraháljuk. Az oldószeres extraktumot betöményítjűk, és a kívánt terméket vízzel nem elegyedő, szerves oldószerbe, például metilén-kloridba, etilacetátba, kloroformba, butanolba vagy metil-izobutilketonba extraháljuk át. Az oldószeres extraktumot betőményítjük, és a nyersterméket szükség szerint kromatográfiával, például preparatív, fordított fázisú, nagynyomású folyadék- kromatográfiával tovább tisztítjuk. A termék rendszerint az (I) általános képlett! vegyületek keveréke, ahol R2 4’ -(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandroziloxi-csoport, R1 hidroxilcsoport, és a kettőskötés hiányzik, vagy pedig R1 hidrogénatom és a kettőskötés van jelen, továbbá R3 hidrogénatom vagy metilcsoport. A komponensek aránya azonban függ az adott mutánstól és a primer vegyülettől, valamint az alkalmazott feltételektől is. Az R csoport eredete, vagyis, hogy közvetlenül az RCOOH általános képlett! vegyületből, vagy a fenti előanyagok egyikéből, vagy bármely más előanyagból származik, lényegtelen az avermektinek termelése szempontjából. A találmány szerinti, az avermektinek termelésére szolgáló eljárás lényegi követelménye, hogy a kívánt R csoportot a találmány szerinti S. avermitilis törzsek számára hozzáférhetővé tegyük a fermentáció során. Az alkalmas vegyületek például a következők: 2.3- dimetil-vajsav, 2-metil-hexánsav, 2-metil-pent-4-énsav, 2- ciklopropil-propionsav, 4.4- difluor-cilohexán-karbonsav, lítium-só, 4-metilén-ciklohexán-karbonsav, 3- metil-cilohexán-karbonsav (cisz/transz), 1 -cilopentén-karbonsav, 1 -ciklohexén-karbonsav, tetrahidro-pirán-4-karbonsav, tiofén-2-karbonsav, 3-furánsav, ciklobután-karbonsav, ciklopentán-karabonsav, ciklohexán-karbonsav, cikloheptán-karbonsav, 2-metil-ciklopropán-karbonsav, 3 -ciklohexén-1 -karbonsav, 2- (metil-tio)-propionsav, v tiofén-3-karbonsav, -hidroxi-metil-ciklopentán, -i: 3- tiofén-karbaldehid, 3-ciklohexil-propionsav 3 -ciklohexil-propionsav, 3-ciklopentil-propionsav, hidroxi-metil-ciklobután, tetrahidro-tiofén-3-karbonsav, 3-ciklopentil-1 -propanol, 3-metil-ciklobután-karbonsav, lítium-só, 3-fluor-ciklobután-karbonsav, 3-metilén-ciklobután-karbonsav, lítium-só, tetrahidro-tiopirán-4-karbonsav, ciklobutil-metil-amin, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
