203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 nyos körülmények között természetes avermektineket termelő tenyészetekké alakulhatnak vissza. Egy adott mikroorganizmus törzs kívánt alléljának mutagenezissel való előállításán túl, egy más törzsben előállított, vagy azonosított kívánatos alléit protoplaszt fúzióval is bevihetünk az adott törzs kromoszómájába. Például, egy sem elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz, sem elágazó láncú aminosavtranszamináz- aktivitással nem rendelkező S. avermitilis törzs és egy, mindkét előbbi aktivitással rendelkező S. avermitilis törzs protoplasztjainak fúziójával olyan S. avermitilis törzset hozhatunk létre, melynek csak az elágazó láncú aminosav- transzamináz aktivitása hiányzik. Amint azt az e tárgyban járatos szakemberek jól tudják, a protoplaszt fúziós eljárás lehetővé teszi a különböző vonalakon kiválasztott, kívánatos allélok egyetlen törzsben való kombinációját. Az itt leírt S. avermitilis JC- 923 (ATCC 53669), elágazó láncú aminosav-transzamináz-hiányos törzs is e módszer terméke. A találmány szerinti mutánsok morfológiai és tenyésztési jellemzői lényegében megegyeznek a 4.429.042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban foglaltakkal. A jelen találmány szerinti mutánsok megkülönböztető jellemzője az itt leírtak szerint meghatározott, elágazó láncú 2-oxosav- dehidrogenáz- és/vagy az elágazó láncú aminosav-transzamináz- aktivitás hiánya. Az említett aktivitások hiánya ahhoz vezet, hogy e mutánsok az RCOOH általános képletű zsírsavaktól [ahol az R izopropil- vagy (S)szek-butil-csoport], vagy a fermentáció során ilyen RCOOH általános képletű zsírsavakká általakítható vegyületektől lényegében mentes, definiált táptalajban növekedve nem képesek természetes avermektinek bioszintézisére. Az American Type Culture Collection által vezetett rendszertani vizsgálatok megerősítették, hogy a fenti 14C02 vizsgálat alapján kiválasztott 1-3 és HL-026 mutáns törzsek közeli rokonságban állnak a 4.429.042 számú amerikai szabadalmi leírásban megadott ATCC 31272 szülőtörzzsel, azonban néhány különbség itt megállapítható. így az 1-3 (ATCC 53567) törzs lényegesen kevesebb spóraláncot fejleszt, mint az ATCC 31272, a HL-026 (ATCC 53568) mutáns törzs pedig gyakorlatilag nem fejleszt légmicéliumot és spórákat, ám az az igen kevés spóralánc, amely létrejön, hasonlójellegű az ATCC 31272 spóraláncaihoz. A HL-026 mutáns törzs további jellegzetessége, hogy a másik két törzsnél kevesebb melanin pigmentet termel, és egyedülálló módon egyáltalán nem termeli ezt a pigmentet tirozin-tartalmú agaron. Végül, a 4.429.042 számú amerikai szabadalmi leírásban az ATCC 31272 törzsre megadott leírással ellentétben, nem volt kimutatható a mutánsok vagy az ATCC 31272 törzs növekedése szacharózt egyedüli szénfonrásként tartalmazó táptalajon. Az 1-3 és a HL-026 mutánsok csak az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitással nem rendelkeznek. Az 1-3 (ATCC 53567) mutáns törzs további mutagenezisével nyert, kétszeresen hiánymutáns PGS-119 (ATCC 53670) törsz, illetve a protoplaszt-fuzióval előállított JC-923 (ATCC 53669) törzs rendszertanilag hasonló viszonyban van az ATCC 31272 törzzsel, mint az 1-3 mutáns törzs. A Streptomyces avermitilis 1-3, HL-026, PGS-119 és JC-923 törzseket a Budapesti Szerződéssel összhangban, a Maryland-i Rockville-ban, az American Type Culture Colletion törzsgyűjteményében helyeztük letétbe; ez az elismert gyűjtemény biztosítja a letétek állandóságát, és a szabadalmi jogok elnyerése után a közönség számára való gyors hozzáférhetőséget. A fenti törzsek a Streptomyces avermitilis ATCC 53567, 53568, 53670 és 53669 sorszámot kapták. A szabadalom elbírálásának ideje alatt a letét csak az United States Patent and Trademark Office megbízottja által fejogosított személyek számára férhető hozzá, a 37 CFR 1.14 és 35 USC 122 szerint, és azon országok szabadalmi jogszabályaival összehangban, ahol ezen szabadalom megfelelőit vagy utódait benyújtják. A letétbe helyezett mikroorganizmusok hozzáférhetőségét érintő valamennyi korlátozás végérvényesen megszűnik a szabadalmi védettség megszerzésével. A S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 és NCIB 12121 törzsek mindegyike termeli az (I) általános képlet szerinti természetes avermektineket, ahol a 22-23-as-helyzetben levő szaggatott vonal az esetleges kettőskötést jelenti; a kettőskötés hiányában R1 hidroxilcsoportot egyébként hidrogénatomot jelent R2 a (II) képletű 4’-(a-L-oleandrozil)a-L-oleandrozil-oxicsoportot; R3 hidrogénatomot vagy metilcsoportot; és ahol R izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoprotot jelent. A 4,285,963 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy olyan, (I) általános képletű avermektint ismertetnek, ahol a 25-ös helyzetben egy metil- vagy egy etilcsoport található, az R1 hidroxil-, az R3 pedig metilcsoport. Az itt leírt, nem-természetes avermektinekben R az alábbiakban meghatározott, izopropil- vagy (S)-szekbutil-csoporttól különböző szubsztituens. Az (I) általános képletű vegyületek bioszintéziséhez nélkülözhetetlen vegyületek a S. avermitilis sejtekben találhatók meg. Ezek, vagyis az L-valin, az L-leucin és az L-izoleucin, jelenlegi ismereteink szerint az avermektinek bioszintézisébe lépve 2-oxosavakká alakulnak, majd az oxosavakat az elágazó láncú 2-oxosavdehidrogenáz dekarboxilálja, és ezzel párhuzamosan a terméket koenzim-A-hoz kapcsolja. Jelenlétük magyarázza az (I) általános képletű izopropil- és (S)-szekbutil- vegyületek egyidejű termelését. Ez-síermészetesen felveti az izopropil-származékoknale*z (S)szek-butil-származékoktól való elválasztásának problémáját. Amikor a találmány szerinti mutánsokat a megfelelő primer vegyületeket is tartalmazó táptalajban fermentáljuk, a mutánsok egy (I) általános képletű vegyületet, vagy leggyakrabban két vagy több (I) általános képletű vegyület keverékét termelik, ahol R a felhasznált primer vegyületnek felel meg. Legfeljebb négy termék képződhet, melyeket a 4,429,042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban megadott jelölések felhasználásával egyszerűen R-avermektin-Al, A2, Bl, B2-nek neve5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
