203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 sékletű lágy-agarral rétegezzük felül a regenerálódó protoplasztokat. 5) A protoplasztokat 7-10 napig inkubáljuk. A tenyésztő- és regeneráló-táptalaj, valamint a protoplasztáló puffer Komplett regeneráló táptalaj (A Hopwood és munkatársai: Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, p. 235 (1985) alatt leírt táptalaj módosítása) Alap-oldat: szacharóz 205 g kálium-szulfát 0,25 g magnézium-klorid»6H20 10,12 g glükóz 10 g Difco kazaminsav 0,1 g Difco élesztőkivonat 5,0 g Difco zabliszt-agar 3,0 g Difco Bacto-agar 22,0 g desztillált víz 955,0 ml-ig Az alap-oldatot 25 percen át, 121 °C hómérsékleten, autoklávban sterilezzük. Sterilezés után a következő steril törzsoldatokat adjuk az alap-oldathoz: kálium-dihidrogén-foszfát (0,5%) 10 ml kálium-klorid*2H20 5 ml L-prolin (20%) 15 ml MES puffer (1,0 mól) 10 ml nyomelem-oldat* 2,0 ml nátrium-hidroxid (1 n) 3,0 ml. Az oldat pH-ját 6,5-re, térfogatát pedig 1 1-re állítjuk be. ♦-Nyomelem-oldat összetétele (per liter): cink-ldord 40 mg vas-klorid*6H20 200 mg réz-klorid*2H20 10 mg mangán-klorid*4H20 10 mg dinátrium-tetraborát* IOH2O 10 mg ammónium-molibdát*4H20 10 mg. Spektinomicint tartalmazó lágyagar, felülrétegezéshez Összetétele azonos a fenti komplett regeneráló táptalajjal, kivéve: agar 4,10 g. A fentiek szerint, autoklávban sterilezzük. Lehűtjük 55 °C-ra, és 100 mg spektinomicint adunk hozzá. 5 ml-es alikvokotra osztva kupakos tenyésztőcsövekbe mérjük. Lehűtjük, majd közvetlenül felhasználás előtt újra sterilezzük autoklávban. Módosított protoplasztoló (P) puffer Alap-oldat: szacharóz 205 g kálium-szulfát 0,25 g magnézium-klorid«6H20 2,02 g desztillált víz 977 ml-ig. 25 percen át, 121 °C hőmérsékleten, autoklávban sterilezzük. Sterilezés után sorrendben steril törzsoldatokat adjuk hozzá: a következő kálium-dihidrogén-foszfát (0,5%-os) 1 ml nyomelem-oldat* 2 ml kalcium-klorid»2H20 (3,68%-os) 10 ml MES puffer (1,0 mól) 10 ml. Az oldat pH-ját 6,5-re, térfogatát 1 1-re állítjuk be. *-A nyomelem-oldat összetételét lásd fenn. Módosított élesztőkivonat-malátakivonat (YEME) táptalaj Alap-oldat: Difco élesztőkivonat 3 g Difco Bacto-pepton 5 g Difco Bacto malátakivonat-tápoldat 3 g glükóz 10 g szacharóz 300 g desztillált víz 973 ml-ig. 25 percen át, 121 “C-on, autoklávban sterilezzük, Sterilezés után a következő törzsoldatokat adjuk hozzá: magnézium-klorid»6H20 (2,5 mólos) 2 ml glicin (20%-os) 25 ml. Az oldat térfogatát 1 1-re állítjuk be. Az alábbiakban bemutatjuk a következő példákban leírt eljárásokhoz használt táptalajok összetételét. A molekulatömeg-meghatározásokat VG Model 7070E tömegspektrométeren, trietilén-glikol, plusz szilárd nátrium-klorid minta-mátrixot használva, gyors atomokkal való bombázáson alapuló tömegspektrometriával végezzük el. Az (M+Na)+ értékeket határozzuk meg. Az mit érték meghatározása érdekében elektron- ütközésen alapúló tömegspektrometriát végzünk VG Model 7070F tömegspekrométeren. Csak a legfontosabb fragmensekre vonatkozó értékeket jegyezzük fel. AS-7 táptalaj hidrolizált kemányítő® g/1 20 Ardamine pHb 5 Pharmamediac 15 kalcium-karbonát 2 •-Készítéskor a kémenyítőt a Bacillus licheniformis a- amiláz enzimével („Termamyl” márkanéven a Novo Enzymes, Wilton, CT hozza forgalomba) 40%±5% glükóz-egyenértékig elhidrolizáljuk. b-A Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012 terméke. c- A Traders Protein., Memphis, TN 38108 terméke. Az oldat pH-ját 7,2-ne állítjuk be nátrium-hidroxiddal. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
