203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 AP-5 táptalaj g/1 hidrolizált keményítő 80 Ardamine pH 5 dikálium-hidrogén-foszfát 1 magnézium-szulfát»7H20 1 nátrium-klorid 1 kalcium-karbonát 7 vas-szulfát*7H20 0,01 mangán-klorid*7H20 0,001 cink-szulfát»7H20 0,001 P-2000 (habzásgátló) 1 ml/1. Az oldat pH-ját 25%-os nátrium-hidroxiddal 6,9-re állítjuk be. WPM SynA 40:40 g/1 1 desztillált víz hidrolizált kemyényítő 40 oldható burgonyakeményítő 40 glutaminsav 1,0 arginin 0,168 cisztin 0,084 hisztidin 0,069 leucin 0,798 lizin 0,297 metionin 0,108 fenilalanin 0,168 teronin 0,174 triptofán 0,048 tirozin 0,192 dikálium-hidrogén-foszfát 1,0 magnézium-szulfát*7H20 1,0 nátrium-klorid 1,0 kalcium-karbonát 3,5 vas(II)-szulfát*7H20 0,01 mangán-klorid»4H20 0,001 cink-szulfát»7H20 0,001. Az oldat pH-ját 6,8-7,0-ra 121°C hőmérsékelten keverjük. állítva, 30 percen át, WPM SynB 40:40 g/1 1 desztillált víz oldható burgonyakeményítő 40,0 hidrolizált keményítő 40,0 glutaminsav 0,390 arginin 0,168 cisztin 0,084 hisztidin 0,069 lizin-hidrogén-klorid 0,297 metionin 0,108 fenilalanin 0,168 treonin 0,174 trioptofán 0,048 tirozin 0,192 dikálium-hidrogén-foszfát 1,0 magnézium-szulfát*7H20 1,0 nátrium-klorid 1,0 kalcium-klorid 3,5 vas(II)-szulfát*7 H2O 0,01 mangán-klorid*4H20 0,001 cink-szulfát*7H20 0,001. Az oldat pH-ját 6,8-7,0-ra beállítva, 30 percen át, 121 °C hőmérsékleten keverjük. Általános nagynyomású folyadék-kromatogáfiás (HPLC) eljárások A mozgó fázis: 150 ml víz és 70 ml acetonitril elegyét metanollal 1 1-re egészítjük ki. Az oszlop: Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100) Átfolyási sebesség: 0,75 ml/perc. Detektálás: 240 nm hullámhosszú ultraibolya fénnyel. Kiegyenlítés közel 6. A minta oldószere (D): 35 ml acetonitril, plusz 390 ml metanol. A standardok: 1. 0,5 mg avermektin-A2A-t mérünk 10 ml térfogatú mérőedénybe, majd metanollal jelig töltjük. 2. A vizsgált termék 0,5 mg-ját 10 ml térfogatú mérőedénybe mérjük, majd metanollal jelig töltjük. Az 1. és 2. oldat a standard törzsoldatot; a futtatásnál használt standard oldat elkészítésekor 100 pl 1-es törzsoldatot és 100 pl 2-es törzsoldatot mérünk egy üvegedénybe, majd 800 pl mozgó fázist adunk hozzá. A minták: 1. Jól össze rázot tenyészetből 1 ml-es mintát veszünk, és lecentrifugáljuk. 2. Eltávolítunk annyi felülúszót, amennyi az üledék felkavarása nélkül csak lehtséges. 3. Az üledékhez 100 pl, nagynyomású folyadék- kromatográfiához használható vizet mérünk, és vortexen kevertetve diszpergáljuk az üledéket. 4. 2 ml oldószert (D) adunk a diszperzióhoz, és jól elkeverjük. 5. Az így előállított mintát szűrjük, és nagynyomású folyadék- kromatográfiával (HPLC) vizsgáljuk. A természetes avermektineket a fenti, nagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárással vizsgáljuk, az egyes avermektineket képviselő csúcsok retenciós idejét pedig elosztjuk a jelen lévő, és az adott nagynyomású folyadék-kromatográfiás meghatározás belső standardjaként használt oligomicin-A-nál megfigyelt retenciós idővel. Az oligomicin-A, mint a S. avermitilis törzsekkel végzett fermentációk mellékterméke, majdnem mindig megfigyelhető a nagynyomású folyadék-kromatográfiás görbéken, és ez alkotja az itt leírt mutánsok egyetlen, nagynyomású folyadék- kromatográfiával kimutatható termékét is, amikor a mutánsokat RCOOH (ahol az R a fentebb meghatározott csoportokat jelöli) összetételi savaktól, vagy az RCOOH (ahol az R a fentebb meghatározott csoportokat jelöli) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
