203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására

1

HU 203 130 B

2

riumacetát, 10 g/1 3-(N- morfolino)-propán-szulfonsav-nátriumsó, 20 g/1 Bacto agar (Difco), pH-7,0.

2) A micéliumokat eldobható zúzó segítségével homogenizáljuk.

3) A homogenizált telepeket a fenti A. 3) pont szerint adjuk a YEME táptalajhoz.

D. Protoplasztok előállítása glicin jelenlétében nőtt

micéliumokból

1) A tenyészeteket 8-as fokozatra állított, 29 °C hőmérsékletű, rázatott vízfürdőn körülbelül 65 órán át inkubáljuk.

2) a micéliumokat fáziskontraszt-mikroszkópban, 40-szeres nagyítású objektívvei vizsgáljuk, majd polipropilén centrifugacsőben 1475 g-n, 10 percen át, 20°C hőmérsékleten centrifugáljuk.

3) A felülúszót kiöntjük, a micéliális üledéket pedig 10 ml protoplaztáló (P) pufferban (lásd alább) felszuszpedáljuk. Az üledéket a micéliumcsómók szétoszlatása ésdekében szövethomogenizátorral 5-10- szer homogenizáljuk.

4) A mintát körülbelül 1000 g-n, 10 percen át centrifugáljuk. A felülúszót kiöntjük, és az üledéket 10 ml P-pufferban óvatosan szuszpendáljuk.

5) A fenti lépést (mosást) megismételjük.

6) A micéliumokat 10 ml P-pufferral készített, 1,0 mg/ml koncentrációjú, friss lizozim-oldatban szuszpendáljuk; a lizozim-oldatot előzőleg 0,22 mikron pórusméretű szűrőn átszűrve sterilizáljuk. A micéliumokat 37 °C hőmérsékletű vízfürdőben, 60 percen át, óvatosan rázatva inkubáljuk. A micéliumokat minden

15. percben újra felszuszpendáljuk a lizozim-oldatban. A mintákban a protoplasztok jelenlétét mikroszkóposán, 40-szeres nagyítású objektívvei, fázismegvilágításban vizsgáljuk.

8) A micélium-készítményeket 5 ml-es pipettával háromszor fel- lepipettázzuk, hogy a protoplasztokat kiszabadítsuk a sejtfalak közül.

9) A készítményeket üveggyapoton, vagy nem-abszorbeáló gyapoton át szűrjük.

10) A protoplasztokat körülbelül 1000 g-n, 7 percen át centrifugálva kiülepítjük, 5 ml P-pufferban óvatosa szuszpendáljuk, és 40-szeres objektívvei, fáziskontraszt- mikrószkópban vizsgáljuk.

11) A fentiek szerint kiülepítjük, majd 1,0 ml P-pufferban szuszpendáljuk a protoplasztokat. Ebből a szuszpenzióból P-pufferral, és desztillált vízzel hígításokat készítünk, és regeneráló táptalaj-lemezekre szélesztjük azokat. A desztillált vízzel hígított protoplasztkészítményekből származó telepeket a nem-teljesen vagy egyáltalán nem-proptoplasztálódott micéliumdarabokból fejlődött sejteknek tekintjük.

12) A protoplasztok 200-300 pl-es alikvotjait jégben, -70 °C hőmérsékleten lefagyasztjuk. Az alikvotokat 18-24 órával később kivesszük a jégből.

A protoplasztok polietilén-glikol (PEG) 1000-rel indukált fúziója

1) Az itt leírt kísérletek mindegyikét egyetlen tétel, körülményeink között látszólag alacsony toxicitást

mutató PEG 1000-rel (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) végezzük.

2) A PEG 1,0 g-os alikvotjait üvegedényekben, autoklávval sterilezzük, ezután 1,0 ml P-puffert adunk hozzájuk, és a PEG-et az edény 55 °C-ra való felmelegítésével oldjuk fel, vagy pedig a kimért PEG-et P- pufferban feloldjuk, és az oldatot közvetlenül felhasználás előtt, szűrve sterilezzük. A PEG-oldatokat szobahőmérsékleten adagoljuk.

3) Friss protoplasztokat készítünk, vagy a -70 °C-on tárolt alikvotokat gyorsan, folyóvíz alatt felolvasztjuk. Mindkét genotípusból közelítőleg azonos számú protoplasztot pipettázunk óvatosan egy polikarbonát centrifúgacsőbe. Frissen készített protoplasztok használatakor turbiditást mérünk, és náhány különböző koncentrációjú sejtszuszpenziót fuzionálunk. Valamennyi minta térfogatát P-pufferral 5,0 ml-re állítjuk be.

4) A fúziós elegyet körülbelül 1000 g-n, 7 percen át centrifugáljuk.

5) Óvatosan leöntjük a felülúszót. A protoplaszt üledéket P-pufferral, 200 pl végtérfogatban szuszpendáljuk.

6) Gyorsan 800 pl 50%-os PEG-oldatot adunk a fúziós elegyhez. A preparátumot Pasteur-pipettába felszívva, majd abból kiengedve összekeverjük. A fúziós reakcióelegyet 2 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. 9 ml P-pufferral kihígítjuk a PEG- et. Az egyes fúziókat egymás után végezzük, hogy az inkubálási időtartamok pontosak legyenek.

7) A fúziós elegyeket a fenti 4) pont szerint centrifugáljuk, a felülúszót óvatosan elöntjük, és a fuzionált, mosott protoplasztokat 1,0 ml P-pufferban szuszpendáljuk.

8) A fúziós elegyből sorozat-hígítást (10_1 és 10J) készítünk P-pufferral.

9) Minden kísérletben kontrollként, mindegyik törzset önmagával is fuzionáltatjuk, és az így nyert mintákat szélesztjük.

10) Mindegyik protoplaszt preparátum hígításait szélesztjük (életképes sejtszám), hogy meghatározzuk a fúziós eljárás során használt valamennyi törzs életképes, regenerálódó sejtjeinek számát.

Eljárás a protoplasztok regenerálására

1) A protoplaszt-szuszpenziókat, fúziós elegyeket vagy az önfúziós mintákat szükség szerint P-pufferral hígítjuk; és 100 |xl-es alikvotonként regeneráló agar táptalajra, óvatosan szétkenve szélesztjük. Nem javítja lényeges mértékben a regenerálást, ha a fuzionált protoplasztokat lágy-agar fedőrétegben szélesztjük.

2) Ha szükséges, a fenti D) 11. pontban leírt eljárást alkalmazzuk.

3) A regeneráló lemezeket tetejükkel felfelé, lezárt műanyag zacskókban, 29-30 °C hőméréskleten, körülbelül 95%-os páratartalom mellett inkubáljuk.

4) Azoknál a protoplaszt-fúzióknál, ahol domináns szelektálható genetikai markéiként spektinomicin-rezisztenciát használunk, a szélesztést követő 18. órában 3,5 ml, 100 pg/ml spektinomicint tartalmazó, autoklávban sterilezett, és a felhasználáskor 45 'C hőmér-5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60*

12