203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 A találmány elágazó láncú aminosav-transzamináz és/vagy elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkezó Streptomyces avermitilis törzsekkel végzett fermentációs eljárás természetes, illetve nem-természetes avermektinek termelésére. A 4,310,519 és a 4,429,042 számú amerikai szabadalmi leírásokban leírják, az erős parazitaellenes hatással rendelkező rokon természetű hatóanyagok komplexeit, az avermektineket, valamint ezek előállítását Streptomyces avermitilis törzsek így a S. avermitilis ATCC 31267, 31271 és 31272 törzsek levegőztetett fermentációjával. Az utóbbi két törzs a S. avermitilis ATCC 31267 ultraibolya besugárzás után nyert tenyészeteinek lefagyasztott, illetve fagyasztva szárított tenyészete. Az 1987. március 18-án publikált 214,731 számú európai szabadalmi leírásban számos olyan vegyületet írnak le (ezekre itt mint nem- természetes avermektinekre hivatkozunk), melyek hasonlóak a természetes, vagy ismert avermektinekhez, ám a 25-ös helyzetben új szubsztituens csoportot tartalmaznak. Ebben a szabadalmi leírásban megadják a fenti nem-természetes avermektinek előállítását egy avermektin-termelő mikroorganizmus bizonyos meghatározott karbonsavak, ezek származékai, illetve előanyagai jelenlétében végzett fermentációjával. Az említett új C-25- szubsztituált avermektinek termelésére használt S. avermitilis törzsek a S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 és az NCIB 12121. Az utóbbi mikrooroganizmus, melyet a 214,731 számú európai szabadalmi leírás ismertet, a S. avermitilis ATCC 31271 törzs származéka. Félszintetikus tápolajokban tenyésztve nagyobb mennyiségben termel újfajta C-25-szubsztituált avermektineket. Az ATCC 31267, 31272 és az NCIB 12121 sorszámú törzsek az új C-25- szubsztituált származékok mellett különböző mennyiségben termelhetik az ismert, vagy természetes avermektineket, ahol a 25- ös helyzetben levő szubsztituens izopropil-, vagy (S)szek-butil-(l-metil-propil)-csoport. Az avermektinek szénváza (melyet az (I) általános képletben mutatnak be) ecetsavból, illetve propionsavból, a természetes avermektinek C-25-szubsztituense pedig L-izoleucinból [R=(S)- szek-butil], vagy L-valinból (R-izopropil) származik [Fisher és Mrozik, „Macrolide Antibiotics”, Acedemic Press (1984), Ch. 14]. Az „ismert” vagy „természetes” avermektinek alatt azokat a S. avermitilis ATCC 31267, 31271 és 31272 sorszámú törzsek által termelt avermektineket értjük, ahol a 25-ös helyzetben levő szubsztituens vagy izopropil-, vagy (S)-szek-butil-(l-metil- propil)-csoport. Azokat az avermektineket, ahol a 25-ös helyzetben található szubsztituens nem izopropil- vagy szék- butilcsoport (S-forma), az alábbiakban új, vagy nem természetes avermektineknek nevezzük. A fent említett amerikai szabadalmi leírásokban megadott S. avermitilis törzsek termelte „természetes” hatóanyag-csoportot átfogóan C-076-nak nevezik. E csoport nyolc különböző, bár közeli rokonságban levő vegyületből áll, melyeket C-076, Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a és B2b jellel jelölnek. Az „a”-val jelölt vegyületsorozat azokat a természetes avermektineket jelenti, ahol a 25-ös helyzetben levő szubsztituens (S)szek-butil-csoport, míg a „b”-sorozat a 25-ös helyzetben izopropil-szubsztituenst tartalmazókat jelöli. Az „A”, illetve „B” megjelölés az 5-ös helyzetben metoxi-, illetve hidroxilcsoportot tartalmazó avermektinekre utal. Végül az „1” a 22-23-as helyen kettőskötést és R1 helyében hidrogénatomot a „2” pedig a 22-es helyen hidrogénatomot, és a 23-as helyen hidroxilcsoportot tartalmazó avermektinekre vonatkozik, ahol a 22-23 helyen egyes kötés van. A jelen leírásban nem alkalmazunk hasonló jelöléseket a nem- természetes avermektinek 25-ös helyzetben levő szubsztituenseire vonatkozóan. Az Al, A2, B1 és B2 jelöléseket a fentiekben leírt szerkezetű természetes avermektineknek megfelelő, nem-természetes avermektinek jelölésére tartjuk meg. Elágazó szénláncú a-ketonsav-dehiderogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok előállításáról Bacillus subtilis [Willecke és Pardee, J. Bioi. Chem., 246, 5264-72. (1971)] és Pseudomonas putida esetében [Martin és munkatársai, J. Bacteriology, 115, 198-204. (1973)] már beszámoltak, Streptomyces-ek esetében azonban még nem. Schulman és munkatársai [J. Antibiot. 38 (11), 1494-1498. (1985)] írták le a lényegében kizárólag Alá és A2a avermektin-aglikonokat termelő S. avermitilis Agly-1 mutáns törzset. Úgyszintén beszámoltak a S. avermitilis Agly-1 törzs sinefungin jelenlétében végzett fermentációjáról, melynek során B-avermektin ágiikon- komponensek megnövekedett mennyiségében termelődtek. Hasonlóan, az avermektineket jól termelő S. avermitilis 08 törzset sinefungin O-metil-transzferáz inhibitor jelenlétében fermentálva, az ágiikon C-5-ös helyzetében, és az oleandróz diszacharid-részen O-metil-csoportot nem tartalmazó avermektinek termelődtek. A 4,378,353 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik a C-076-tal rokon vegyületeket, valamint azok előállítását a S. avermitilis ATCC 31272 törzsből ultribolya besugárzással nyert MA-5218 jelű mutáns törzs tenyésztésével. A mutáns az ATCC 31780 azonosító számot kapta. A nevezett mutáns által termelt, C-076-tal rokon vegyületekből hiányzik a C-076 furán-gyűrűje. Továbbá, az ismertetett vegyületek közül néhányban az egyik, vagy mindkét oleandróz cukkorrész felhasadt, míg másokban az 5-ös helyzetben levő csoport ketoncsoporttá oxidálódott. O-metil-csoportot nem tartalmazó avermektineket termelő S. avermitilis O-metil-transzferáz-mutánsok három osztályáról számoltak be Ruby és munkatársai [6th International Symposium on the „Biology of Actinomycetes”, Debrecen, Hungary, August 26- 30.(1985)], és Schuman és munkatársai [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 744-747. (1987)]. Az első mutáns osztály elsősorban B-avermektineket termel, mivel nem képesek a makrociklusos lakton-gyűrű C-5-ös hidroxilcsoportjának metilálására. A második 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
