203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 osztály a demetü-avermektineknek nevezett, 3’-0, 3”O-bisz-demetil-aveimektineket termeli (ezek olyan avermektinek, ahol mindkét oleandróz monoszaccharid-maradék 3-as helyzetében hiányzik az O-metilszubsztituens). A harmadik osztályba tartozó mutánsok egyetlen helyen sem tudják metilálni az alapvegyületet. Sculman és munkatársai [Fed. Proc., 44, 931. (1985)] megnövekedett B-avermektin-termelést írnak le a S. avermitilis olyan anyagok jelenlétében végzett fermentációjával, mint a sinefimgin, az S-adenozil-ationin és az S-adenozil-homocisztein, melyek gátolják az aglikon-rész C-5-ös hidroxilcsoportjának az avermektin-B-O-metil-transzferáz által katalizált metilálását. O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező, és avermektin-B komponenseket megnövekedett menynyiségben termelő Streptomyces avermitilis mutánsokra hivatkoznak Schulman és munkatársai az Antimicrobial Agents and Chemotharapy, 29, 620-624. (1986) folyóiratban megjelent közleményükben is. A S. avermitilis törzs sejtjeit mutagenizálva, elágazó láncú 2- oxosav-dehidrogenáz- vagy elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsokat kapunk. Az így előállított, egyszeresen blokkolt mutánsok mutagenezise sem elágazó láncú 2- oxosav-dehidrogenáz-, sem elágazó láncú aminosavtranszmináz-aktivitással nem rendelkező mutánsokhoz vezet. A mutánsok többé nem képesek lényeges menynyiségben természetes avermektinek előállítására kívülről adott RCOOH általános képletű vegyületek hiányában, ahol az R izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoport, vagy olyan vegyületek hiányában, melyek RCOOH általános képletű vegyületekké képesek alakulni a fermentációs folyamat során. Meglepő és váratlan módon azonban a mutánsok természetes, és nem-természetes avermektineket termelnek, ha a fermentációt kívülről hozzáadott RCOOH általános képletű vegyületek jelenlétében, illetve az ilyen RCOOH általános képletű vegyületek előanyagai jelenlétében végezzük, ahol is az R izopropil- vagy (S)-szek-butil-, vagy az itt leírt más csoport. Még meglepőbb, hogy az itt leírt, mindössze az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitással nem rendelkező, és így az L- izoleucin vagy az L-valin lebontására képtelen mutánsok képesek a vegyületek széles skáláját bevonni az avermektin bioszintézisébe, természetes avermektinektől mentes, nem-természetes avermektineket termelve. Legalább ilyen meglepő az is, hogy az itt leírt, elágazó láncú amionosav-transzaminázzal nem rendelkező mutánsok, melyek képtelenek az L-izoleucin, az L-valin vagy az L-leucin lebontására, és ezt a három aminosavat igénylik is növekedésükhöz, szintén képesek más vegyületek beépítésével természetes avermektinektől mentes, nem-természetes avermektineket termelni. A természetes avermektinek nyolc különböző, de közeli rokonságban álló vegyület összetett keverékeként termelődnek; lásd az (I) általános képletet, ahol R-izopropil-, és (S)-szek-butil-csoport. Habár lényegében tisztán kinyerhetők (lásd a 4,429,042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást), a módszer legjobb esetben is munkaigényes. A 214,731 számú európai szabadalmi leírásban közöltek szerint eljárva, a nem-természetes avermektinek termelése során különböző mennyiségben néhány természetes avermektin is termelődik, mivel a nem-természetes avermektinek előállítására használt S. avermitilis mikroorganizmus sejtjeiben az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz, valamint az L-valin és az L-izoleucin aminosavak is jelen vannak. A termékek számának, illetve komplexitásának a minimumra való csökkentése, illetve egy adott avermektin tisztaságának növelése érdekében kívánatos, hogy választhassunk a természetes vagy a nem-természetes avermektinek termelése között. Elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz- vagy elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező S. avermitilis törzseket avermektin-termelő S. avermitilis törzsek, elsősorban a S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272, vagy az NCIB 12121 mutagenezisével állítunk elő. Az említett deficiens törzsek egyikének vagy másikának további mutagenezise mindkét aktivitást nélkülöző törzseket eredményez. A mutánsok nem képesek természetes avermektinek szintézésére, kivéve, ha fermentációs táptalajuk izopropil- vagy szek-butil-(S-forma)-csoportot hordozó zsírsavat, vagy annak előanyagát tartalmazza. A mutánsok képesek természetes vagy nem-természetes avermektinek termelésére, ha fermentációjukat levegőztetett körülmények között, vizes közegben, a megfelelő primer savat, vagy a fermentáció során ez utóbbivá átalakulni képes vegyületet tartalmazó táptalajban végezzük. Az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitás hiányával jellemezhető mutánsokat a mutagenizált telepek közül 14C02 teszt alapján választjuk ki. Az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitás hiányát jelzi a módszer szerint az, hogy a permeábilissá tett telepek nem fejlesztenek C14 jelzett szén-dioxidot [14C-l]-2oxo-izokapronsav vagy [14C-l)-2-oxo-3-metil-valeriánsav vagy [14C-l]-2-oxo-3-metil-vajsav szubsztrátból. A mutagenizált telepek közül annak alapján választjuk ki az aminosav-transzamináz-aktivitás hiányával jellemezhető mutánsokat, hogy ezek nem képesek L- izoleucin-, L-leucin- és L-valin-mentes táptalajokon növekedni. A gyakorlatban a glükózt és sókattartal mazó, a kazaminsavban megtalálható minden egyes aminosavval kiegészített agar táptalajon növő egyedi telepeket L-izoleucin-, L-leucin- és L-valin-mentes, egyébként azonos összetételű táptalajra visszük át. Az itt leírt kizárólag az elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsok az avermektinek termeléséhez előanyagként el tudják használni a 2-oxosavakat. Meglepő és váratlan, hogy az itt leírt, az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz- és/vagy az elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsok megtartják avermektin-, elsősorban pedig nem-természetes avermektin- termelő képességüket. A 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
