203046. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporint tartalmazó szemészeti gyógyszerkészítmények előállítására
HU203046B 7 8 zó vegyületek egyetlen adagjának lokális alkalmazását követően mérhető szisztémás (vér-) koncentrációk meghatározása. E célokat oly módon valósíthatjuk meg, hogy megvizsgáljuk a Ci-3H megoszlását a szem különböző szöveteiben, valamint a kapott 5 Ci-3H vérszinteket (azaz, a szisztémás koncentrációkat). A Ci-3H-t oly módon állítjuk elő, hogy standard eljárások segítségével triciummal jelöljük a ciklosporin A (-MeBmt-) aminosavgyökét, például úgy, 10 ahogy azt Voges és munkatársai ismertetik az „Izotóppal jelzett vegyületek szintézise és alkalmazása” (’’Synthesis and Applications of Isotopically Labeld Compounds”) című kötetben (Ed. R.R. Muccino, Elsevier Press Amsterdam, 371-376,1986) szerep- 15 lő, „Tritiated Compounds for In-Vivo Investigation) című közleményükben. A vegyület tisztaságát és azonosságát NMR spektroszkópia, a TLC/radioaktív TLC arány és a fordított fázisú HPLC módszer segítségével állapítottuk meg. Nem jelzett ciklospo- 20 rin A felhasználásával elkészítettük a Ci-3H 1:10 arányú hígítását, és ezt alkalmaztuk a vizsgálatok során. Kísérleteinkhez fehér, New Zealand törzsből származó, 4-6 kilogramm testsúlyú nőstény nyula- 25 kát használtunk (Láb. Rab. Co.). Az állatokat standard nyúlketrecekben helyeztük el, ellenőrzött étrenden (Purina Chow) tartottuk őket, vizet azonban tetszés szerinti mennyiségben fogyaszthattak. A vizsgált készítmény alkalmazását követően körül- 30 belül egy órán keresztül a nyulakat normális, felegyenesedett helyzetkalodába zártuk. A vizsgált vegyületeket 20 pj-es, illetve 19,9 mg-os dózisokban adagoltuk, kalibrált pipetta segítségével. A pipettákat gondosan megtöltöttük oly módon, 35 hogy légbuborékok ne kerüljenek bele, majd a vizsgált készítményt a nyulak mindkét szemének tölcsér alakú, alsó szemhéj alatti zsákszerű részébe vittük be, gondos körültekintéssel. Ezt követően a szemhéjakat egy másodpercig finoman összezárva tartót- 40 tűk, majd elengedtük. Megvizsgáltuk a nyulak szemét, nem észlelhetők-e rajtuk irritációs jelek, irritáció okozta könnyezés vagy homályosság. Ezt a vizsgálatot a Draize-teszt Calgon-féle módosítása szerint végeztük, preparáló lámpát használva a rés- 45 lámpa helyett (Draize, J. H„ „Az élelmiszerekben, gyógyszerekben és kozmetikumokban található kémiai anyagok biztonságosságának vizsgálata” — .Appraisal for the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics” —, ,Az Egyesült Államok 50 Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrző Hivatalában dolgozó egyesülete — Association of Food and Drug Officials of the United States —, texas State Department of Health, Austin, Texas, 1959. A módosítás a Calgon Consumer Products Research 55 Labs — „Calgon-féle kutatólaboratórium fogyasztási termékek vizsgálatára” — alapján történt (Toxicology, 1973). A gyógyszeradagolást követően 0,3,1,2,4,6,12, 24,48 é 96 órával hármas csoportonként öltük le az 60 állatokat. Ezt közvetlenül megelőzően vérmintákat vettünk a nyulak szélső fülvénáiból. Az állatok leölése oly módon történt, hogy szélső fülvénáikba T- 61 Euthanasia oldatot (Hoechst) fecskendeztünk. Ezt követően mindkét szemet élettani sóoldattal 65 (0,9%NaCl) öblítettük át, majd anélkül távolítottuk el, hogy a környező vérereket átszakítottuk volna. A szemek felületét gondosan átöblítettük, majd szűrőpapír segítségével megszárítottuk, annak éredekében, hogy eltávolítsunk minden, esetleg a könnyben található gyógyszermaradványt. Ezután a csarnokvizet távolítottuk el egy 26-os méretű, 3/8 hüvelyk —körülbelül 1 cm—hosszúságú tű segítségével, melyhez egy 0,2 millüiteres (ml) pipetta csatlakozott, amit a szaruhártya szélére helyeztünk. A szaruhártyát a széli részen kimetszettük, ezt követően pedig a szivárványhártyát és a sugártestet együttesen távolítottuk el. Ezt követően kivettük a szemlencsét, és mintát vettünk az üvegtestből is. Ennek megmaradó részét oly módon távolítottuk el a többi szövettől, hogy a szűrőpapír segítségével leitattuk. Ezután az inhártyáról lekapartuk az érhártyát és az ideghártyát, majd mintát vettünk azinhártyának a látóideg közvetlen közelében található részéből. A szennyeződés elkerülése érdekében minden egyes szövetrész eltávolításához tiszta műszereket használtunk. Ezt követően az egyes mintákat átöblítettük, majd szűrőpapírral leitattuk, és égetőtölcsérekbe mértük bele őket. Körülbelül 200 pJ-nyi vérmintákat szintén égetőtölcsérekbe mértünk. A szövet- és vérmintákat tűk, majd Packard Tri mintaoxidáló készülékbe — (Model 306) helyeztük őket, MonophaseK-40 (Packard Instrument Co.) felhasználásával. Az égetést követően a minták radioaktivitását folyadékszcintillációs módszerrel mértük meg, éspedig Packard Tri-CarbK Liquid Scintillation Spectrometer, Model 460 (folyadékszcintillációs spektrométer) segítségével határoztuk meg. A specifikus aktivitás megállapítása érdekében a vizsgált vegyület 2,0 pj-nyi mintáját 100 ml t-butilmetü-éterben oldottuk fel, majd az éteres oldat 0,1 ml-ét vizsgáltuk meg az égetéses eljárás segítségével. A specifikus aktivitás felhasználásával a szövetek — percenkénti és grammonként bomlászszámmal (dpm/g) jellemezhető radioaktivitási koncentrációját a szövetek, illetve a vér grammonként ciklosporin-tartalmává számíthatjuk át, nanogrammban kifejezve. Valamennyi minta radioaktivitásának meghatározásánál 7%-os statisztikai hibahatárral és 95%-os megbízhatósági szinttel dolgoztunk. Ez azt jelenti, hogy a 3-nál kisebb percenkénti netto beütésszámok (cpm) nem különböznek szignifikánsan a nullától, és ez grammonként 34 pikogrammos (pg/g) meghatározási (érzékenységi) határértéknek felel meg. A vizsgálatok egyik — a fent ismertetett vizsgálati eljárást alkalmazó — sorozatában az alábbi készítményeket hasonlítottuk össze: "A" vizsgált készítmény: Az 1. példában ismertetett, találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmény. ”B ” vizsgált készítmény: Összehasonlításra használt gyógyszerkészítmény, mely az 1. példában leírtakkal azonos mennyiségben tartalmazta a ciklosporin A-t és a (2) és (4) komponenseket, az (1) összetevő — a kukoricaolaj — helyett azonban 4 i ,65% ásványi olajat tartalmazott. "C" vizsgált készítmény: összehasonlításra haszlevegő segítségével szárítot-CarbR Sample Oxidizer — 5
