202928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 9alfa-hidroxi-androszt-4-én-3,17-dion előállítására
1 HU 202 928 B 2 A találmány tárgya eljárás 9a-hidroxi-androszt-4-én- 3,17-dion (9-OH-AD) előállítására szterolok mikrobiológiai átalakításával. A 9-OH-AD a szteroid hatóanyagok előállításának fontos kiindulási anyaga. Ebből a vegyületből nagy hatású és széles körben hasznosítható pregnán típusú^ szteroidok állíthatók elő. Ismert a 9-OH-AD szterésolokból történő előállítása ( 2 647 895. számú NSZK-beli közzétételi irat és 127 455. számú NDK-beli szabadalmi leírás), amelynél a szterol transzformációhoz az NRRL- B-8119, valamint a DSM 752 szám alatt deponált Mycobacterium fortuitum mikroorganizmust alkalmazzák. Ez az eljárás néhány jelentős hátránnyal rendelkezik. így például, olyan mikroorganizmust alkalmaznak, amely a mikobaktériumok potenciálisan patogén fajaihoz tartozik [R.E. Buchanan és munkatársai: Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1975; D.R Nicholson és W. R. Servier: Am. Rev. Resp. Dis. 104, 747-750 (1971)]. A mikroorganizmus alkalmazása esetén ezért szigorú egészségvédelmi, munkavédelmi és környezetvédelmi szabályokat kell betartani. További hátrány, hogy nagyon hosszú fermentációs idő (14-15 nap) után is csak kevés termék képződik. Hátrány továbbá, hogy a fermentáció során keletkező 9- OH-AD-t el kell választani a reagálatlan szteroltól, mivel a fermentációs elegy extrahálása során a termék mellett a kiindulási anyag is az extraktumba kerül. Ez az utolsó hátrány kiküszöbölhető a 77 57 161. számú japán közrebocsátási iratban ismertetett módszerrel, amelynek értelmében a fermentációs elegy extraháláshoz XAD-típusú apoláros adszorbert alkalmaznak, amely szelektív megköti a képződött terméket. Az eljárás javított változatát ismerteti a 232 167. számú NDK- beli szabadalmi leírás, amelynek értelmében ZIMET 10849 számú M. fortuitum törzset alkalmaznak finoman eloszlatott szilárd hidrofób szerves polimer jelenlétében. így 2-6 nap fermentálás után kielégítő mennyiségű 9-OH-AD nyerhető, amelyhez azonban továbbra is potenciálisan patogén törzset alkalmaznak. A 80 85 397. számú japán közrebocsátási irat mikrobiológiai eljárást ismertet 9-OH-AD előállítására, amelynek során szelektív szterol transzformációt hajtanak végre Mycobacterium vaccae törzzsel (M. vaccae MC1-1104). Ennél a megoldásnál apatogén törzset alkalmaznak, a fermentálás termelékenysége nem kielégítő (20 g koleszterolból 8 nap alatt csak 0,83 g 9-OH-AD képződik). A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amely szterolokból kiindulva lehetővé teszi 9a-hidroxi-androszt-4-én- 3,17-dion (9-OH-AD) jó kitermeléssel történő előállítását. A találmány tárgya tehát javított mikrobiológiai eljárás 9ct-hidroxi-androszt-4-én-3,17-dion (9-OH-AD) előállítására, amelynek során fajlagos szterol felhasználás mellett lényegesen rövidebb fermentációs idővel jó kitermeléssel kapjuk a végterméket. Ezt a feladatot a Mycobacterium vaccae törzs segítségével végrehajtott mikrobiológiai transzformálás alapján úgy oldjuk meg, hogy az adott szterol, illetőleg szterol elegy transzformálásához ZIMET 11052 vagy ZIMET 11053 számon deponált M. Vaccae törzset alkalmazunk. A találmány szerinti eljáráshoz alkalmazott törzseket a Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimetelle Therapie für AdW der DDR intézetnél (NDK, Jena, Beutenbergstrasse 11) a fenti számok alatt deponáltuk. A találmány szerinti eljárás során az M. vaccae ZIMET 11052 vagy M. vaccae ZIMET 11053 törzseket aerob és steril körülmények között vizes tápközegben fermentáljuk, amely szterol mellett szénforrást (például glicerin, glükóz, szaccharóz, keményítő vagy laktóz), nitrogénforrást (például élesztő extraktum, karbamid vagy kazein hidrolizátum), valamint ásványi sókat tartalmaz. A fermentáláshoz szterolként szitoszterolt, koleszterolt, kampeszterolt, sztigmaszterolt, ergoszterolt vagy ezek elegyét alkalmazzuk. A szterolt önmagában vagy szterol-tenzid-készítmény formájában adagoljuk a vizes fermentációs közeghez, ahol a szterol koncentráció 1,0-50 g/1. A szterol-tenzid-készítmény előállításához az adott szterolt nedves őrlés, liofilizálás vagy porlasztva szárítás segítségével az alábbi A vagy B csoportba tartozó tenziddel keverjük, ahol a tenzid mennyisége a kész elegyre vonatkoztatva 1,0-20 tömeg%. A vagy B típusú tenzidként alkalmazható 30-70 tömeg% polipropilénglikolt tartalmazó polietilén-oxid (PEO)-polipropilén-oxid(PPO) blokk kopolimer, valamint az N,N”tetra(oxipropilpropiol)-N’-(2- oxipropil)-dietilén-triamin PEO-PPO adduktuma. A fermentálást előnyösen az elő- és főtenyésztés fokozatában 25-35 °C hőmérsékleten 48-96 órán keresztül pH - 6,0-9,0 között végezzük. A fermentációs elegyhez kívánt esetben a fermentálás megkezdése előtt vagy annak során szerves polimer típusú adszorbert adagolunk 10-160 g/1 menynyiségben. Adszorberként előnyösen alkalmazható az etil-vinil-benzolból vagy divinil-benzolból előállított és legalább 200 m2/g specifikus felülettel rendelkező szerves polimer. Adszorberként előnyösen alkalmazható az etil-vinil-benzolból vagy divinil-benzolból poláros csoportokkal, elsősorban akrilsav-észteren alapuló poláros csoportokkal előállított szerves polimerek. A fermentálás megvalósítható különböző térfogatú gömblombikban, nyakas üvegedényben, kevert fermentorban, valamint V2A- acéltankban. A fermentálás befejezése után a képződött 9-OHAD-t az adszorber adagolás nélküli eljárásváltozatnál önmagában ismert módon szerves oldószerrel, előnyösen butil-acetáttal végzett extrahálással, majd ezt követő kristályosítással izoláljuk. Adszorber alkalmazása esetén a feldolgozás az adszorbens, előnyösen szűréssel történő elválasztásával kezdődik, majd az abszorbens szerves oldószerrel, így metanollal, etanollal, acetonnal vagy ezek vizes elegyével eluáljuk, az eluátumot mintegy 10% térfogatra bepároljuk, szűrjük és a 9-OH-AD-t átkristályosítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
