202928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 9alfa-hidroxi-androszt-4-én-3,17-dion előállítására
1 HU 202 928 B 2 A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módja szerint a ZIMET 11053 törzs sejtjeit 140 g/1 fenti adszorbert tartalmazó közegben 96 órán keresztül 28 'C hőmérsékleten fermentáljuk, amelynek során a szterol beadagolástól függően gömblombik méretben 35-50 tömeg% (analitikai érték) 9-OH-AD kitermelést kapunk, ahol a maradék szteroltartalom kisebb, mint 5 tömeg%. Látható, hogy a fenti típusú adszorber alkalmazása nemcsak a képződött 9-OH-AD feldolgozása szempontjából előnyös, hanem jelentős mértékben fokozza a termék képződését és így a szterol felhasználást. A találmány szerinti eljárás előnyei az alábbiakban foglalhatók össze: a 9-OH-AD rövid fermentációs idővel és jó kitermeléssel nyerhető apatogén mikroorganizmus törzs felhasználásával, az adszorber alkalmazása nemcsak a 9-OH-AD tenyészoldatból történő eltávolítását segíti, hanem növeli a kitermelést is (lásd a táblázatot). Kiviteli példák 1. példa Mycobacterium vaccae ZIMET 11053 törzset 7 napon keresztül 28 'C hőmérsékleten a következő öszszetételű ferde agar táptalajon tenyésztjük: 20 g glicerin 5 g baktopepton, 5 g husextraktum, 15 g agar-agar, 1000 ml-hez szükséges desztillált víz, pH- 7,0 (kémcsőkultúra). A kémcsövenként begyűjtött sejtekkel 500 ml-es gömblombikot oltunk be, amely 50 ml alábbi összetételű tápoldatot tartalmaz: 10 g glicerin 10 g élesztő extraktum 0,5 g KH2PO4, 1,5 g (NH4)2HP04, 0,2 g MgS04*7H20, 0,01 g FeS04*7H20, 0,002 g ZnS04*7H20 és 1000 ml-hez szükséges desztillált víz, pH-7,0 A tenyészetet 28 °C hőmérsékleten 200 fordulat/perc sebességgel 72 órán keresztül rázzuk, majd 5 ml előtenyészetet alkalmazunk a fermentációs tenyészet beoltásához. 10 db 500 ml-es gömblombikot 7 g szerves polimerből álló nedves adszorberrel (etil-vinil-benzolból és divinil-benzolból akrilsav- észteren alapuló poláros csoportokkal előállítva), 10 ml szitoszterol-tenzid készítménnyel (100 g szitoszterol, 10 g B típusú tenzid, 1000 ml-hez szükséges desztillált víz, nedves őrlés) és 50 ml fermentációs közeggel töltünk meg. Fermentációs közegként 5 g glükóz 10 g élesztő extraktum, 1,3 g K2HPO4OH2O, 1,5 g (NH4)2HP04, 0,2 g MgS04*7H20, 0,01 g FeSO7H20, 0,002 g ZnS04*7H20 1000 ml-hez szükséges mennyiségű desztillált vízben felvett oldatát (pH-8,0) alkalmazzuk. Az így előkészített lombikokat 20 percen keresztül 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk, majd lehűtés után beoltjuk, végül 28 'C hőmérsékleten 200 fordulat/perc sebesség mellett 96 órán keresztül fermentáljuk. Vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok szerint gömblombikonként 330 mg átlagos 9-OH-AD kitermelést kapunk. 2. példa Az 1. példában leírt módon Mycobacterium vaccae ZIMET 11052 törzsből kémcsöves és előtenyészetet készítünk. 10 db 500 ml-es gömblombikot 4 g fenti típusú nedves adszorberrel, 500 mg szitoszterol-tenzid készítménnyel (500 mg szitoszterol, 50 mg B típusú tenzid benzolban oldva és liofilizálva) és 50 ml 1. példa szerinti összetételű fermentációs közeggel töltünk meg. 28 °C hőmérsékleten 96 órán keresztül végzett fermentálás után gömblombikonként átlag 90,6 mg 9- OH-AD kitermelést kapunk. 3. példa Az 1. példában leírt módon Mycobacterium vaccae ZIMET 11053 törzsből kémcsöves és előtenyészetet készítünk. A fermentációs tényésztés körülményeit az 1. példában leírt módon állítjuk be, azzal a különbséggel, hogy adszorbert nem adagolunk. 28 ‘C hőmérsékleten 200 fordulat/perc sebesség mellett 96 órán keresztül végzett fermentálás után gömblombikonként átlag 120 mg 9-OH-AD kitermelést kapunk. 4. példa Mycobacterium vaccae ZIMET 11053 törzsből az 1. példában leírt módon kémcsöves és előtenyészetet készítünk. 10 db 500 ml-es gömblombikba 5 g szerves polimer típusú adszorbert (etil-vinil-benzolból és divinil-benzolból poláros csoport nélkül előállítva), 5 ml fenti összetételű szitoszterol- tenzid készítményt és 50 ml fermentációs közeget (az összetételt lásd az 1. példában) adunk. 28 ”C hőmérsékleten végzett 72 órás fermentálás után a lombikokat 20 percen keresztül 120 'C hőmérsékleten sterilizáljuk, majd beoltjuk. A tenyészoldatból gömblombikonként átlag 208 mg 9-OH-AD nyerhető. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás 9a-hidroxi-androszt-4-én-3,17-dion (9- OH- AD) előállítására szterol Mycobacterium vaccae törzzsel, aerob és steril körülmények között, szénforrást, nitrogénforrást és ásványi sót tartalmazó vizes tápközegben végzett mikrobiológiai transzformálásával, azzal jellemezve, hogy a transzformáláshoz M. vaccae ZIMET 11052 vagy M. vaccae ZIMET 11053 törzset alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
