202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 A 9D10 antitestet IgM-ként jellemeztük a korábban leírt izotípus meghatározásban és kimutattuk, hogy csupán az LATS-féle 1. törzzsel reagál egy LATS szerotípusokra végzett fajlagossági vizsgálatban. A korábban leírt eljárást alkalmazva az immun-folt elemzéshez, a szóban forgó antitest csak a Fisher-féle 4. immun- típusú LPS-sel reagált, valamint a Fisher-féle 4. immun-típusú baktériumokból nyert külső membránkészítményekkel, létra-szerű profilt mutatva, amely hasonló ahhoz, amelyet a 6F11 antitestnél bemutattunk. A korábbi eljárásokat alkalmazva az in vitro és in vivo aktivitásokhoz, a következő eredményeket nyertük: 3. táblázat Opszonofagocitás vizsgálat: 9D10 antitest8 Komplement15 A beadott 3H-Fisher-féle 4. immun-típusú baktériumok százalékos felhasználása _ _ 8,4 +-4,9 — + 9,5 + + 65,3 a(-)-tenyésztő tápközeg b(-)-hővel inaktivált komplement Az in vivo adatokkal kapcsolatban lásd a III. példa végén levő táblázatban a 9D10 antitestre vonatkozó adatokat, III. példa A ül. példa módszert mutat be Fisher-féle 1. és 4. immun-típusú P. aeruginosa elleni humán monoklonális antitestek előállítására. Az alkalmazott limfocita-forrás epehólyag-fibrózisban szenvedő betegtől származott, akinek széruma több Fisher-féle immun-típusú LPS-re a normálisnál nagyobb litert tartalmazott. Ebben az esetben öt lemezt oltottunk be 15000 PBL/üreg + 140 000 1A2 sejt/üreg koncentrációkkal. Ugyanazt az Iscova-féle tápközeg készítményt alkalmaztuk, amelyet a II. példában leírtunk, de kiegészítettük még 0,5 pg/ml ciklosporán A- val abból a célból, hogy funkcionálisan inaktiváljuk a T-sejteket. Nem volt T-sejt legyengítés az ebben a kísérletben alkalmazott AET-SRBC- vei végzett rozettaképzés során. A ciklosporin A jelenlétét addig tartottuk fenn a tápközegben, amíg az alapminta üreget le nem vizsgáltuk. A tenyészet felülúszók átvizsgálását a II. példában leírt módon hajtottuk végre. A C5D5 jelzésű üregből nyert felülúszó csak a Fisher-féle 4-7. immun-típusú lemezen volt pizitív, és ez Fisher- féle 4. immun-típusú baktériumokra bizonyult fajlagosnak a korábban leírt egyedi immun-típusú antigén lemezeken vizsgálva. A C5B7 jelzésű üregből nyert másik felülúszó csak a Fisher-féle 1-3. immun-típusú lemezen reagált, és ez Fisher-féle 1. immun- típusú baktériumokra bizonyult fajlagosnak a korábban leírt egyedi immun-típusú antigén lemezeken vizsgálva. A jelen szabadalmi bejelentés benyújtása előtt a CSB7 és CSD5 sejtvonalakat elhelyeztük az Amerikai Fajta-tenyészet Gyűjteményben (ATCC), ahol a CRL8753, illetve CRL 8754 megjelölést kapták. Mind a CSD5-ről, mind a CSB7-ről kimutattuk, hogy IgM típusúak, amint ezt a korábban leírt izotípus-elemzéssel meghatároztuk. A CSD5 csupán az LATS-féle 1. törzzsel reagált, míg a CSB7 csak az IATS-féle 6. törzzsel reagált, amint ez várható is volt a Fisher-féle immun-típusok és az IATS-féle szerotípusok közti összefüggésből. Az immun-folt elemzésben a szóban forgó C5D5 antitestről kimutattuk, hogy csak Fisher-féle 4. immun-típusú LPS-sel és a Fisher-féle 4. immun-típusú baktériumokból származó külső membrán-készítményekkel reagált, létra-szerű profilt mutatva hasonlóan ahhoz, mint amelyet a 6F11 antitestnél leírtunk. Egy hasonló immun-folt elemzésben a CSB7 antitest csak a Fisher- féle 1. immun-típusú LPS-sel és a Fisher-féle 1. immun-típusú törzsből származó külső membrán-készítményekkel reagált, létra- szerű profilt mutatva. Az előzőleg leírt in vitro és in vivo vizsgálatok eredményeit a 4. táblázatban adjuk meg. 4. táblázat a. Opszonofagocitás vizsgálat C5D5 Komplement6 A bevitt 3H-Fisher- féle antitest8 4. immun-típusú baktérium százalékos felhasználása-8,4 +-6,3 — + 9,5 + + 56,1 C5B7 antitest8 h 3 Komplement A bevitt H-Fisher-féle 1. immun-típusú baktérium százalékos felhasználása — 6,3 + 6,9-+ 17,7 + + 56,3 8(-)-tenyészet-tápközeg b(-)-hővel inaktivált komplement b. In vivo védelmet vizsgáló tanulmányok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 í. 60 ‘ 10
