202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 C5D5 + 9D10 Élők száma/teljes szám három nappal a baktériumok beadása után Tápközeg 0/10 C5B7 (Anti-Fisher-féle 4. törzs) 10/10 C5B5 (Anti-Fisher-féle 1. törzs) 1/10 9D10 (Anti-Fisher-féle 4. törzs) 8/10 3 nap után nem volt további változás A fertőzés (beadás) adagja: 5LDso élő Fisher-féle 4. immun- típusú baktérium. IV. példa A IV. példa módszert mutat be Fisher-féle 5. és 6. immun-típusú P. aeruginosa elleni humán monoklonális antitest előállítására, továbbá bemutatja az említett antitestek in vivo védő aktivitását homológ törzsek halálos fertőzése ellen. Egy epehőlyag-fibrózisban szenvedő betegtől, akiről tudtuk, hogy krónikus P. aeruginosa fertőzésben szenved, perifériás vérmintát nyertünk. Egymagvú sejteket különítettünk el a vérből az I. példában leírtak szerint. Az érzékeny B sejtek sejttel hajtott transzformálását a ÜL példánál leírtak szerint hajtottuk végre azzal a különbséggel, hogy 23 lemezt oltottunk be 20 000 egymagvú sejt/üreg-gel plusz 80 000 1A2 sejt/üreg-gel kerek fenekű, 96 üreges lemezeken (Costar 3799). A tenyészet felülúszó átvizsgálását fajlagos antitestekre az I. példában leírt ELISA vizsgálat módosított formáját alkalmazva végeztük. Az antigén-lemezek 96 üreges, laposfenekű mikrotitráló lemezekből (Immulon II, Dynatech) álltak, amelynek üregei különböző élő baktériumokat tartalmaztak az üregek fenekéhez adszorbeálva. Hogy megkönnyítsük a baktériumok adszorpcióját a műanyaghoz, 50 )il/üreg poli-L-lizint (PLL) (1 jAg/ml PBS-ben, pH 7,2) inkubáltunk 30 percen át szobahőmérsékleten. A nem adszorbeált PLL-t azután kiráztuk, a lemezeket egyszer kimostuk PBS- sel, 50 pl, PBS-ben levő, mosott baktérium-szuszpenziót (OD66O-0,2) adtunk minden egyes üreghez, és a lemezeket inkubáltuk 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. A nem adszorbeált baktériumokat a lemez háromszori sóoldat-Tween-es átmosásával [0,9% NaCl, 0,05% (térfAérf.) Tween-20] távolítottuk el. A lemezek baktérium- összetétele ugyanaz volt, mint az I. példánál azzal a kivétellel, hogy E. coli vagy K. pneumoniae lemezei nem alkalmaztunk. Az ELISA eljárást úgy indítottuk el, hogy először a lemezeket blokkoltuk 200 pl/üreg blokkoló pufferal [PBS, pH 7,2, amely még 5 súly/térf, % nem zsíros tejport, 0,01% (térfVtérf.) Antifoam A (Sigma) habgátlót és 0,01 tömeg/térf. % Timerozált is tartalmaz] 60 percen át szobahőmérsékleten. A blokkolás után a lemezeket háromszor mostuk sóoldat-Tween-nel (lásd fentebb). 50 pl PBS-t (pH 7,2), amely még 0,1% Tween 20-at és 0,2% (tömeg/térf.) BSA-t is tartalmazott, helyeztünk minden egyes üregbe. A tenyésztő lemezek üregeiből származó felülúszókat egy másolat (replika) lemezre helyeztük, az antigén-lemezek megfelelő üregeibe 50 pl-t helyezve, és a lemezeket 30 percen át inkubáltuk szobahőmérsékleten. A felülúszókat ezután eltávolítottuk, az üregeket háromszor mostuk sóoldat-Tween-nel (lásd fentebb), és 50 pl megfelelően hígított torma-peroxidázt (HRP), amely kecske anti- humán IgG + IgM-hez (Amerikán Qualex International, A 1114 szám+A 1124 szám) volt hozzákapcsolva, adtunk az üregekhez. Ebben a példában a HRP-kecske anti-IgG-t és HRP-kecske anti-IgM-et 1:5000, illetve 1:3000 végső hígításban alkalmaztuk, a hígítást PBS-ben (pH 7,2) végezve, amely még tartalmazott 0,05% Tween 20- at és 0,1% BSA-t, 30 perces inkubálást követően szobahőmérsékleten, az enzimmel konjugált kecske antitestek fölöslegét eltávolítottuk és az üregeket háromszor mostuk sóoldat-Tween-nel. Az ELISA mérés további részét, beleértve a szubsztrátum hozzáadását és az ezt követő színkifejlesztést, az I. példában leírtak szerint hajtottuk végre. A fenti módszerrel végezve a tenyészet felülúszók elemzését, az elemzés két olyan üreg (13C1 és 5G2) azonosításához vezetett, amelyek csak a Fisher-féle 4- 7. immun-típusú lemezeken voltak pozitívak. ELISA- val ezt követőén egyedi immun-típusú antigén lemezeken meghatároztuk, hogy a 13C1 üregben levő antitest Fisher-féle 5. immun-típusú volt, míg az 5G2 üregben levő antitest Fisher-féle 6. immun-típusra volt fajlagos. Az I. példában leírt módon, de ELISA formát és a jelen példában lein HRP-anti-humán IgG és HRP- anti-humán IgM reagenseket alkalmazva elvégzett izotípus-meghatározás IgM reagenseket alkalmazva elvégzett izotípus-meghatározás IgM izotípust mutatott ki a fenti Fisher-féle immun-típusú fajlagos antitestek mindegyikéhez. A 13C1 és 5G2 ürekegből származó fajlagos antitesttermelő sejtek klónozását úgy végeztük, hogy a sejteket mindkét üregből egymástól függetlenül számtalan korlátozott hígítású klónozási sornak vetettük alá, amíg az összes vizsgált klónozott felülúszó a fenti ELISA eljárással nem eredményezett pozitív reakciót a megfelelő Fisher-immun-típussal. A klónozást 96 üreges kerekfenekű lemezeken hajtottuk végre, 1*105 besugárzott (2400 Rád) humán PBL-lel, mint tápláló sejttel üregenként. Hét nappal később további 1*105 besugározott PBL-t adtunk minden egyes üreghez. Az így létrejött klónozott sejtvonalat, amely anti-Fisher-féle 6. immuntípusú humán monoklonális antitestet termelt, 5G2-vel jelöltük. A klónozó vonalak bármelyike által termelt monoklonális antitest ugyanazt a jelzés viseli, mint a megfelelő vonal, amely előállította azt. A jelen szabadalmi bejelentés benyújtása előtt az itt leírt 13C1 és 5G2 sejtvonalakat elhelyeztük az Amerikai Fajtatenyészet Gyűjteményben (ATCC), ahol ezek a CRL 8796 és CRL 8797 jelzést kapták. Az immun-folt elemzést a hét Fisher-féle immuntípus mindegyikéből nyert külső membrán készítményen (OMP) hajtottuk végre 13C1 és 5G2 monoklonális antitestekkel, amint ezt az I. példában leírtuk, de 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
