202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 némi, kővetkező módosításokkal. A monoklonális antitestet inkubáláia és az ezt követó PBS-Tween- és mosási sorozat Után az NCM foltok mindegyikét 1 órán át 25 °C hőmérsékleten inkubáltuk 1:1000 hígításban (PBS-Tween-ben) levó, kecske-anti humán IgG 5 + IgA + IgM-mel (Zymed) kapcsolt alkálikus foszfatázzal. A foltoklt azután ötször öt perces mosásnak vetettük alá PBS-Tween-ben, ekkor pedig az antigénantitest kölcsönhatást láthatóvá tettük a foltokat 20-30 percig 25 °C hómérsékleten 30 ml nitro-kék-tetrazóli- 10 um/5-bróm-4-klór-3- indolil-foszfát (NBT-BCIP) szubsztrámmban inkubálva, amint ezt Leary és munkatársai leírták (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80, 4045-4049). A IXÍn kifejlesztésének leállítására a foltot többször ionmentes vízben leöblítettük. A 13C1 és 15 5G2 monoklonális antitestek pozitív reakciót csak homológ antitest: bakteriális külső membrán kombináció esetében adtak. Ez azt jelenti, hogy a 13C1 monoklonális antitest csupán a Fisher- féle 5. immun-típusú baktériumok OMP-jável reagált, míg az 5G2 monok- 20 lonális antitest csupán a Fisher-féle 6. immun-típusú baktériumok OMP-jével reagált. A reakció mindkét esetben szabályos térközú csíkok létra-szerű profilját eredményezte, ami arra enged következtetni, hogy az LPS a felismert molekuláris cél. Annak alátámasztá- 25 sára, hogy az LPS a célzott antigén, meg kell továbbá jegyezni, hogy a létra-szerű profilok változatlanok voltak minden esetben, amikor az OMP-ket hővel kezeltük (100 °C, 1 ófa), majd 60 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáltuk K proteináz (Boehringer, Mannheim, 30 NSZK) jelenlétében (10-20 pg/50 pg fehérje a mintában) az elektroforézis előtt. Az utóbbi kezelésről ismert, hogy elroncsolja a fehérje-antigéneket. A 13C1 és 5G2 humán monoklonális antitestek in vitro funkcionális aktivitását vizsgáltuk meg opszonofagocitás baktericid vizsgálatban. Triptonos-szójás tápközegben nőtt, logaritmikus növekedési fázisban levő baktériumokat nyertünk ki a tenyészetből, újra szuszpendáltunk Hanfc-féle kiegyensúlyozott sóoldatban, amely még 0,1% zselatint és 5 mmól/1 HEPES-t is tar- 40 talmazott (HBSSÄ3EL/HEPES), ODőóo-O.IOO értékre, majd ugyanezzel a puffénál 1:1000 arányban felhígítottuk. Egészséges önkéntesek alvadt véréből származó szérum szolgált humán komplementer-forrásként. Használat előtt kilenc rész szérumot egyesítettünk 1 45 rész 0,1 mól/l-es EDTA-val (pH 7,2), majd adszorbeáltattuk P. aeruginosa hét Fisher-féle immun-típusával, amint ezt az I. példában részletesen leírtuk. Hogy megakadályozzuk az alternatív út komplement-komponenseinek aktiválódását, az abszorbeált szérumot tovább 50 kezeltük zymosan-nal (Sigma) a properdin eltávolítása céljából, amint ez* Bjomson és Michael leírták [/. Inf Dis. (1974), 130. Kiegészítés, S 119- S 125J. A reakciót l,5»l-es, polipropilénből készült kúpos csőben úgy indítottuk meg, hogy 100 pl baktérium- 55 ----szuszpenziót egyesítettünk 50 pl, monoklonális antitestet tartalmazó feSWszóval. 30 percen át szobahőmérsékleten végzett Wtubálás után 50 pl komplementet, 50 pl neutrofil sejt saiezpenziót és 250 pl HBSS/GEL/HEPES-t adtunk miiifen egyes csőhöz. A csöveket további 60 egy órán át inkubáltuk 37 ‘C hőmérsékleten, rázógépen, ezután 10 pl-t minden csőből összekevertünk 3 ml folyékony triptonos-szójás agaira! (45 °C hőmérsékleten) és a keveréket triptonos-szójás agarlemezekre öntöttük. Miután az agart megfelelő ideig szilárdulni hagytuk, a lemezre további 3 ml folyékony triptonosszójás agart rétegeztünk. A lemezeket egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten, és a következő napon a keletkezett baktérium- telepeket megszámoltuk Quebec telepszámlálóval. Megfelelő kontrollokat is vettünk fel, hogy megvizsgáljuk az antitest fajlagosságát, valamint azt, hogy a baktericid aktivitás vajon az opszonofagocitózis eredménye volt vagy sem; a kontrollokat úgy készítettük, hogy (1) nem a megfelelő monoklonális antitestet adtuk a megfelelő antitest helyett, illetve (2) a neutrofil sejteket HBSS/GEL/HEPES-sel helyettesítettük. Amint az alábbi 5. táblázatból látható, a 13C1 és 5G2 monoklonális antitestek baktericid hatásúak voltak homológ törzseiket illetően. Az eredmények minden esetben azt jelzik, hogy az opszonizált baktériumok fagocita-felvétele a humán neutrofil sejtek által elsődlegesen felelős a baktérium-szám csökkenéséért. Ezeknek a kísérleteknek a megismétlése nem homológ antitest-baktérium kombinációkkal nem eredményezett bakteriális felvételt, így demonstrálva a fenti antitestek, mint opszonizáió antitestek mindegyikének funkcionális fajlagosságát. 5. táblázat Opszonofagocitás baktericid vizsgálat 13C1 antitest8 Neutrofil sejtekb Baktérium-telepek számac 35-— 844 +-721 — + 756 + + 11 8(-)-humán anti-Fisher-féle 2. immun-típusú 6F11 monoklonális antitest b(-)-HBSS/GEL/HEPES csupán c-a kísérlet Fisher-féle 5. típusú baktériummal volt végrehajtva 5G2 antitest8 Neutrofil sejtek*5 Baktérium-telepek számac— 451 +-422 — + 570 + + 166 2. immun-típusú 6F11 monoklonális antitest b(-)-HBSS/GEL/HEPES csupán c-a kísérlet Fisher-féle 6. típusú baktériummal volt végrehajtva 12
