202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 Organizmus Antibiotikum Nocardia különböző fajok különböző poliéterek Streptomyces albus A204, A28695A és B, és szalinomicin aureofaciens naraszin cacaoi var. asoensis lizocellin chartreusis A23187 cinnamonensis monenzin conglobatus ionomicin eurocidicus var. asterocidicus laidlomicin flaveolus CP38936 gallinarius RP 30504 griseus grisorixin hygroscopicus A218, emericid, DE 3936, A120A, A28695A és B, eteromicin és dianemicin lasaliensis laszalocid longwoodensis lizocellin mutabilis S-11743a ribosodificus Ionomicin violaceoniger nigericin Streptoverticillium különböző fajok különböző poliéterek A kromoszomális és plazmid DNS izolálása után egy szóban forgó antibiotikum-termelő organizmusból, a jelen módszer az elkészített DNS genetikai könyvtárának a megalkotását igényli. A genetikai könyvtárak megalkotásának számos módja van, és ha bizonyos méretkorlátozásokat, amelyeket leírunk, figyelembe veszünk, ezeknek a módszereknek bármelyikét alkalmazhatjuk a jelen módszeren belül. Streptomyces genetikai könyvtár előnyös megalkotási módszerét mutatja be például a 2. példa. A genetikai könyvtárak megalkotására szolgáló különböző módszerek elsődlegesen a kromoszomális és plazmid DNS-ek készítéséhez alkalmazott restrikciós enzimek és/vagy molekuláris kapcsolók (linkerek) tekintetében különböznek, amely DNS-ek a könytár megalkotásához alkalmazott rekombináns DNS klónozó vektorba való beiktatáshoz szükségesek. Ideális esetben számos könyvtár alkotható meg mindegyik antibiotikum-termelő fajból, ahol mindegyik könyvtár a rekombinás DNS klónozó vektorba való beiktatáshoz készített kromoszomális és plazmid DNS-sel van megalkotva különböző restrikciós enzimekkel és/vagy molekuláris linkerekkel. A könyvtárak választéka elkészítésével ilyen módon minimálissá tesszük a szóban forgó antibiotikum bioszintetizáló gén elhasadását és ezáltal valószínűleg elroncsolását a könyvtár megalkotása során. A genetikai könyvtárak különböznek a könyvtár megalkotásához alkalmazott rekombináns DNS klónozó vektorba beiktatott kromoszomális és plazmid DNS-e átlagos méretében is. Amint fentebb megállapítottuk, a nagyobb beiktatott részek kívánatosak, hogy a teljes bioszintetikus utak klónozhatók legyenek. A DNS beiktatott szakasz méretének szabályozására szolgáló egyik módszer a nagy DNS fragmensek gondosan figyelt emésztése. Általános szabály, hogy minél hosszabb az emésztési idő, annál kisebb az így létrejött emésztési termék, amíg a teljes emésztést elérjük. A DNS fragmensekre bontható egy sor mechanikai módszerrel is, ha az enzimatikus módszer valami miatt ellenzett. A mechanikai módszerek általában azt igénylik, hogy a DNS legyen módosítva DNS linkerek hozzáadásával a DNS-hez, vagy olyan kezeléssel, amely a DNS-t tompavégűvé teszi a fragmensekké bontás művelete után. A genetikai könyvtár megalkotása irányítható a könyvtár megalkotásához alkalmazott rekombináns DNS klónozó vektor kiválasztásával. A jelen találmány szerinti előnyös rekombináns DNS klónozó vektor képes replikálódni mind E. coliban, mind Streptomycesben. Az ilyen kétfunkciós klónozó vektor, amelyet „ingázó” vektornak is hívnak, lehetővé teszi az antibiotikum bioszintetizáló gént tartalmazó DNS manipulációját E. coliban, amely DNS manipulációhoz kitűnően alkalmas organizmus, és lehetővé teszi az antibiotikum bioszintetizáló gént tartalmazó DNS bevezetését Streptomycesbe számos intermedier rekombináns DNS klónozó vektor megalkotása nélkül. A jelen találámány szerinti módszerben a genetikai könyvtárak megalkotásában való felhasználáshoz előnyös rekombináns DNS klónozó vektorokat a 655 178 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben és a 655 178 sorozatszámú bejelentés részbeni folytatását jelentő 742172 sorozatszámú bejelentésben (iktatószám 6422A) ismertetik, (A T/38676 sz. MAGYAR NYILVÁNOSSÁGRAHOZATALI IRAT), ezek a vektorok a pKC420, pKC427, pKC428, pKC448, pKC462, pKC462A és pKC467. A jelen módszer azonban nem korlátozódik egy bizonyos rekombináns DNS klónozó vektor alkalmazására. Nagy számú klónozó vektor létezik, amely alkalmas a jelen bejelentés céljaira, így pl. a 4 416 994; 4 343 906; 4 477 571; 4 362 816 és 4 340 674 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett „ingázó” vektorok. ik jelen találmány nem korlátozódik a kétfunkciós vektorok alkalmazására sem, vagy az E. coli és Streptomyces kétfunkciós vektoraira sem, mivel az E. coli és egy antibiotikum termelő organizmus, mint pl. a Bacillus, Cephalosporium vagy Penicillium közti kétfunkciós vektorok éppen úgy hasznosak lennének. A jelen módszert végre lehet hajtani monofunkcionális vektorokat alkalmazva is, ilyen pl. a pBR322 plazmid, a Charon fágok, a 0C31 fág, az SCP2 plazmid, az SCP2* plazmid, a pU702 plazmid, és ezeknek a vektoroknak a származékait. Miután a genetikai könyvtárat megalkottuk, az antibiotikum- rezisztencia átadásáról ismert DNS-szegmenseket először jelzéssel látjuk el, majd érintkezésbe 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
