202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 hozzuk az első genetikai könyvtárral olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a DNS komplementer szálak hozzáforrasztását. Ez a „hozzáforrasztási” művelet, vagy hibridizálás, a jelen találmány fontos lépése, és egy sor fontos tényező kritikus ennek a lépésnek a sikeres kivitelezéséhez. Mivel a rezisztenciát átadó gén úgy működik, mint vizsgáló minta, amely megtalálja és azonosítja az antibiotikum bioszintetizáló géneket tartalmazó kromoszomális és/vagy plazmid DNS szegmenseket, az egyes antibiotikum rezisztencia átadó DNS szegmens kiválasztása fontos tényező a jelen módszerben. A jelen találmány egy különösen előnyös kiviteli módjában a jelen találmány szerinti módszerben használt rezisztenciát átadó gén olyan organizmus által termelt antibiotikum elleni rezisztenciát ad át, amelyből a kromoszomális vagy plazmid DNS-t izoláltuk. így pl. az aciltranszferázok, adenililtranszferázok, foszfotranszferázok és metiltranszferázok rezisztenciát adhatnak át az aminociklitol antibiotikumokra. így olyan DNS szegmenst alkalmazva, amely aciltranszferázt, adenililtranszferázt, foszfotranszferázt vagy metiltranszferázt kódol a jelen módszerben az aminociklitol bioszintetikus gén-tartalmú DNS szegmensek azonosítására, a jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjához jutunk. Nem minden aminociklitol termelő organizmus tartalmazza az aminociklitol rezisztencia átadó gén azonos típusát. így szükséges lehet rezisztencia átadó gének választékának az alkalmazása, mielőtt sikeresen izolálnánk egy aminociklitol bioszintetikus gént tartalmazó DNS fragmenst. A makrolid, linkózamid és streptogramin antibiotikum-termelő organizmusok gyakran tartalmaznak antibiotikum rezisztencia átadó géneket, mint pl. metiltranszferázokat. Valójában a legtöbb rRNS metiltranszferáz átad rezisztenciát makrolid, linkózamid és streptogramin antibiotikumok széles választéka ellen, ezért ezeket „MLS rezisztencia determináns”-oknak nevezik. Ezért a jelen találmány egyik előnyös kiviteli módja magában foglalja egy metiltranszferázt kódoló DNS szegmens alkalmazását makrolid, linkózamid és spektrogramin bioszintetizáló gén-tartalmú DNS szegmensek azonosítására. Különösen fontos megjegyezni, hogy a jelen módszer eszközt nyújt antibiotikum bioszintetizáló gének izolálására olyan organizmusokból, amelyek genetikailag csak szegényesen vannak jellemezve. Mivel a különböző fajokból származó antibiotikum rezisztencia gének gyakran mutatnak homológiát, és néhány tudós úgy véli, hogy sok organizmus rendelkezik antibiotikum rezisztencia átadó génekkel transzpozon-szerű elemek tevékenysége révén [Israeli-Reches és munkatársai: Mol. Gen. Genet. 194, 362 (1984)], a jelen módszert lehet alkalmazni antibiotikum bioszintetikus gének izolálására egy olyan nemzetség fajaiból, amelyek eltérők attól a nemzetségtől, amelyből az antibiotikum rezisztencia átadó gént izolálták. Nem ismeretes a rezisztencia átadó gének jelenléte a megelőző táblázatokban felsorolt antibiotikumok néhányánál. A jelen találmány azonban nem korlátozódik egy adott rezisztencia átadó génre. A jelen módszer e helyett leírja, hogyan lehet alkalmazni bármilyen antibiotikum átadó gént antibiotikum bioszintetizáló gének azonosítására. Ezért legyenek bár antibiotikum rezisztencia gének a jelen találmány bejelentési dátuma után felfedezve, a jelen találmány magában foglalja azoknak az új rezisztencia átadó géneknek az alkalmazását is a jelen módszerben. Ezentúl a jelen módszert lehet alkalmazni antibiotikum bioszintetikus gének izolálására olyan organizmusokból, amelyek olyan antibiotikumokat termelnek, amelyhez rezisztencia-átadó gén nem ismeretes. A jelen találmány egy ilyen kiviteli módjában az organizmus kromoszomális és plazmid DNS-ét hibridizáljuk egy olyan rezisztencia átadó génhez, amely más antibiotikumokra fajlagos, mint azok, amelyekről tudjuk, hogy termelnek. Néhány organizmus „csendes” vagy „rejtett” bioszintetikus génekkel rendelkezik [Jones és munkatársai: J. Bioi. Chem. 259, 14158 (1984)]. Ezek a csendes gének nem csupán az organizmus aktív bioszintetikus génjeihez kapcsolódnak, hanem rendelkezhetnek rezisztencia átadó génnel is, amely fajlagos arra az antibiotikumra, amely a csendes bioszintetikus utat termelheti. Ezentúl az ismeretlen rezisztencia átadó gén ahhoz az antibiotikumhoz, amelyet az organizmus termel, lehet homológ egy ismert rezisztencia-átadó génnel. Bármelyik esetben a jelen találmányt lehet alkalmazni antibiotikum bioszintetizáló gének izolálására olyan organizmusokból, amelyek olyan antibiotikumokat termelnek, amelyekhez rezisztencia átadó gén nem ismeretes. Nagyon sok rezisztencia gén ismert. Az ezután következő X. táblázatban bemutatunk sok (de nem az összes) ismert rezisztencia átadó gént, és idézzük azokat a referátumokat, amelyek ismertetik ezeket a géneket. A X. táblázatban levő letéti számok vagy a törzsre, vagy a plazmidra vonatkoznak, amelyekből a rezisztencia átadó gént izolálni lehet. Az ATCC az American Type Culture Collection, amely Rockvilleban (Maryland 20852) található. Az NRRL a Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, US, Department of Agriculture, amely Petoriában (Illinois, 61604) helyezkedik el. Amint fentebb megállapítottuk, a jelen találmány nem korlátozódik az antibiotikum rezisztencia átadó gének egy adott készletére. Az antibiotikum rezisztencia átadó gének izolálásának módszerei jól ismertek a szakterületen. Egy ilyen módszert Thompson és munkatársai írnak le (Nature, 286, 525 (1980)]. Az antibiotikum rezisztencia átadó gének izolálási módszerei, mint pl. Thompson és munkatársai módszere is, általában magában foglalja DNS klónozását egy antibiotikum-termelő organizmusból, és a klónozott DNS transzformálását egy második organizmusba, amely érzékeny arra az organizmusra, amelyet az első organizmus termel. A második organizmus transzformánsai, amelyek rezisztensek az antibiotikumra, vélhetően tartalmaznak egy antibiotikum rezisztencia átadó gént. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
