202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 Az antibiotikum bioszintetizáló gének jelenlétét egy rekombináns DNS klónozó vektoron lehet azonosítani olyan módon is, hogy egy vad-típusú állapotban levő antibiotikum blokkolt mutánst transzformálunk a rekombináns vektorral. Ezenkívül az antibiotikum bioszintetizáló gének jelenlétét és típusát meg lehet határozni enzimes mérésekkel is, pl. azokkal, amelyeket Seno és Baltz leírtak [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 20(3), 370, (1981)]. Az alábbi példákat tartalmazó részben a jelen találmány szerinti módszer bemutatását nyújtjuk. A példák illusztrálják a pIJ 43 plazmád eritromicin rezisztencia átadó génjének, amelyről úgy véljük, hogy egy riboszomális DNS metiltranszferázt kódol, alkalmazását az eritromicin bioszintetizáló gének azonosításához, összhangban a jelen találmánnyal. Az eritromicin rezisztencia átadó gén nem csupán hibridizál fajlagos módon számos eritromicint vagy más antibiotikumot termelő organizmus kromoszomális vagy plazmid DNS-éhez, hanem az eritromicin rezisztencia átadó gént alkalmazzuk a jelen találmány módszerében egy olyan rekombináns vektor azonosítására is, amelyről kimutattuk, hogy az eritromicin antibiotikum bioszintetizáló útját kódolja, amely előreviszi az eritromicinek kifejeződését egy olyan gazdaszervezetben, amely, amikor nem transzformált, nem termel hasznos antibiotikumot. így a példák illusztrálják a jelen találmány hasznosítását és a jelen találmány általános alkalmazhatóságát az antibiotikum termelő organizmusokhoz. 1. példa Streptomyces erythreus kromoszomális és plazmid DNS izolálása A Streptomyces erythreus számos rokon vegyületet termel, amelyeket eritromicineknek neveznek (eritromicin A-F és eritronolid). Az eritromicinek kereskedelmileg fontos antibiotikumok, amelyeket fermentációval állítanak elő. Az eritromicin bioszintetizáló gének klónozása olyan rekombináns DNS klónozó vektorokhoz vezethetne, amelyek növelhetnék az eritromicinek termelését a S. erythreus fermentációkból. Ez a példa leírja a S. erythreus kromoszomális és plazmid DNS izolálását. Mintegy 250 ml triptikáz szója tápközeget, 30 g oxoid Tryptone Soya Broth 1 1 vízben (BBL Microbiology Systems, P.O.B. 243, Cockeysvine, MD 21030) eritromicint tartalmaz, inokulálunk Streptomyces erythreus (NRRL 2338) tenyészetével, és a tenyészetet 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 24 órán át. A tenyészetet centrifugálással kinyeijük, és a sejtüledéket újra szuszpendáljuk 20 ml oldatban, amely 15%-os szacharózra nézve, és 25 mmól/1 trisz-HCl-t (pH-8) és 25 mmól/1 EDTA-t tartalmaz. 1/100 pl 100 mg/ml-es lizozim oldatot adunk ehhez a sejtkeverékhez, amelyet ezután inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 8 percen át. A lizozimos kezelés után 200 pl 10 mg/ml-es K proteináz oldatot és 750 pl 20%-os SDS-t adunk a sejtkeverékhez, amelyet azután 70 'C hőmérsékleten inkubálunk 8 percen át. A 70 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a sejtkeveréket jégen hűtjük, hozzáadunk 1,5 ml 10 mól/l-es kálium-acetátot, majd jégen inkubáljuk 30 percen át. A sejtkeveréket azután egyszer TE-vel telített fenollal (TE egy olyan puffer, amely 10 mmól/1 trisz HCl-t, pH-7,5 és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmaz) extraháljuk, és centrifugáljuk, hogy elkülönítsük a vizes fázist a fenoltól. A fenolos extrahálás vizes fázisát egyszer extraháljuk SEVAG-gal, amely kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú keveréke. A SEVAG extrakció centrifugálása után a vizes réteghez két térfogat 100%-os etanolt adunk és összekeverjük. Az etanol hozzáadására a DNS kicsapódik és láthatóvá válik, mint fehér anyag az oldatban. Az oldat enyhe keverésére a DNS hosszú szálai összefonódottá válnak és a DNS nagyon laza üledékét alkotják. A DNS laza üledéket elkülönítjük az oldatból, és a DNS- t 5 ml 70%-os etanollal mossuk. A DNS-t azután egy csőbe helyezzük, amely 2 ml TE puffert tartalmaz, és a csövet egy görgő dobba helyezzük egy éjszakára. A görgő dob elég enyhe keverést nyújt úgy, hogy a DNS feloldódik, de nem nyíródik észrevehető mértékben. 1/100 pl RNÁz-t (2 mg/ml) adunk a 2 ml kromoszomális és plazmid DNS-hez, és a keveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percen át. A keveréket kétszer extraháljuk TE-vel telített fenollal, majd kétszer extraháljuk SEVAG-gal. Az utolsó SEVAG-extrahálás után 4 ml abszolút etanolt adunk a vizes fázishoz, és a DNS-t kicsapjuk az oldatból, amint fentebb leírtuk. A DNS-t 5 ml 70%-os etanollal mossuk, levegőn szárítjuk, és újra szuszpendáljuk 1 ml TE pufféiban. Mintegy 5-10 mg Streptomyces erythreus DNS-t nyerünk ezzel az eljárással. A DNS ffagmensek átlagos mérete az oldatban mintegy 70 kb. A fenti módszer alkalmazható Streptomyceshez és más antibiotikum- termelő prokariótákhoz. A gomba DNS izolálásához szolgáló egyik általános módszert mutattak be Tudzynski és Esser [Current Genetics 5, 227 (1982)]. 2. példa Streptomyces erythreus kromoszomális és plazmid DNS-t tartalmazó genetikai könyvtár megalkotása A. A pKC462A kozmid ingázó vektor leírása A T/38676 sz. Magyar Nyilvánosságrahozatali írat leír egy sor kozmidot, amelyek E. coli Streptomyces ingázó vektorok, és amelyek használhatók genetikai könyvtárak megalkotásához. A jelen példa részletezi egy Streptomyces erythreus genetikai könyvtár megalkotását a pKC462A kozmid ingázó vektor segítségével, amelyet az említett irat ismertet. A pKC462A kozmid ingázó vektort E. coli K 12 SF8/pKC462A-ból lehet izolálni, amely az NRRL-nél van letétbe helyezve NRRL B - 15973 letéti számon. A pKC462A kozmid ingázó vektor izolálását a fentebb említett, részbeni folytatást jelentő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 11. példája tartalmazza, amely ide referenciaként van beépítve. A pKC462A kozmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra mutatja be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
