202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 B. A pKC462A kozmid előállítása Mintegy 50 pg pKC462A kozmid DNS-t emésztünk 500 1 1» Hpal pufferban [20 mmól/1 KC1, 10 mmól/1 trisz-HCl, pH 7,4; 10 mmól/1 MgCh, és 1 mmól/1 ditiotreitol (DTT)] 100 egység Hpal restrikciós enzimmel 3 órán át 37 °C hőmérsékleten. Mintegy 50 pl 10*BAP (bakteriális alkalikus foszfatáz) puffert (500 mmól/1 trisz-HCl, pH-8, és 500 mmól/1 NaCl) és 2,5 egység BAP-t (International Biotechnologies, Inc., P.O. Box 1565, New Haven, Connecticut 06506) adunk a Hpal-vel emésztett DNS- hez, és az így létrejött reakciókeveréket 1 órán át inkubáljuk 70 °C hőmérsékleten. A BAP-vel kezelt DNS fenolos, majd SEVAG-os extrahálása után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-t azután 500 pl l»BamHI pufferral emésztjük [150 mmól/1 NaCl; 6 mmól/1 trisz-HCl, pH-7,9, 6 mmól/1 MgCh; és 100 pl/ml szarvasmarha szérum albumin (BSA)] 90 egység BamHI restrikciós enzimmel 3 órán át 37 'C hőmérsékleten. A DNS- t újra extraháljuk fenollal és SEVAG-gal, kicsapjuk etanollal, és feloldjuk 50 ml TE pufferban. C. A DNS beiktatott rész előállítása Mintegy 50 pg, 1. példa szerint előállított Streptomyces erythreus DNS-t inkubálunk 30 egység Mbol-vel l*Mbo pufferban (100 mmól/1 NaCl; 10 mmól/1 trisz-HCl, pH 7,4; 10 mmól/1 MgCh; és 1 mmól/1 DTT) 37 ”C hőmérsékleten 15 percig. Ezt a szóban forgó inkubálási időt találtuk empirikusan olyannak, amely a kívánt részleges fragmens-képződést nyújtja, a DNS fragmenseket -30-45 kb méretűre hagyva. Az Mbol-vel emésztett DNS-t fenollal és SEVAG-gal extraháljuk, majd 50 pl TE pufferban feloldjuk. Mintegy 25 pg Mbol-gyel emésztett Streptomyces erythreus DNS-t kezelünk ezután BAP-vel (1,25 egység az első órában 70 °C hőmérsékleten, majd további 1,25 egység egy további órára 70 °C hőmérsékleten) 100 pl l'BAP pufferban. A BAP-vel kezelt DNS-t azután fenollal és SEVAG-gal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 50 pl TE pufferban feloldjuk. Ennek a DNS-nek a méretét 0,3%-os agaróz gélen becsüljük meg és -30-45 kb-nek találjuk. D. A vektor DNS ligálása a DNS beiktatott részhez Mintegy 125 ng 2 B. példa szerint készített pKC462A DNS-t összekeverünk 500 ng Mbol-vel emésztett, 2 C. példa szerint előállított Streptomyces erythereus DNS-sel, majd ligáljuk 400 egység T4 DNS ligázzal (New England Biolabs, Beverly, Massachussets 01915) 20 pl l»ligáz pufferban (50 mmól/1 trisz-HCl, pH-7,7; 10 mmól/1 MgCh; 20 mmól/1 DTT; és 50 pg/ml BSA), amely ATP-re 1 mmól/ml-es. A ligáló reakciókeveréket 16 óránt át inkubáljuk 16°C hőmérsékleten, majd a reakciót 70 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett melegítéssel állítjuk le. E. In vitro csomagolás A csomagolást úgy hajtjuk végre, hogy mintegy 10 pl ligáló keveréket (-62,5 ng DNS hibrid vektor) Biotec csomagoló készletbe helyezünk (Promega Biotec, 2800 S. Fish Hatchery Road, Madison, Wisconsin 53711) 30 °C hőmérsékletre 1 órára. Mintegy 500 pl 0,1 mól/1 NaCl-t, 0,01 mól/1 trisz-HCl-t, pH-8, és 0,01 mól/1 MgS04-et tartalmazó oldatot adunk a keverékhez a csomagolási reakció után. Mintegy 25 pl kloroformot is adunk a keverékhez a baktériumok elpusztítása céljából. F. Az E. coli K 12 SF8 transzdukciója Mintegy 200 pl, 2 E. példa szerint készített csomagolt kozmidot (25 ng vektor DNS) adszorbeálunk 500 pl E. coli K 12 SF8-ra (NRRL B - 15835), amely 0,2% maltózzal és 10 mmól/1 magnézium-szulfáttal kiegészített TY tápközegen (10 g tripton és 5 g élesztőkivonat/liter) nőtt mintegy 0,7 O.D. 550 értékig. Miután a sejteket mostuk olyan oldatban, amely 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH-8,0) és 10 mmól/1 MgCh-t tartalmaz, az adszorpciót 37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 10 peren át 10 mmól/liter trisz-HCl-t (pH-8,0) és 10 mmól/1 MgS04-et tartalmazó oldatban. Az adszorpció után az E. coli K 12 SF8 sejteket 5 ml TY tápközegben növesztjük egy órán át szobahőmérsékleten, és a transzduktánsokat 30 “C hőmérsékleten szelektáljuk 200 pg/ml apramicint tartalmazó lemezeken. A transzdukált sejtek szélesztésével mintegy 4000 telep jön létre, amely mintegy MO4 transzduktáns/mikrogramm rekombináns vektor DNS transzdukciós hatékonyságot eredményez. Mintegy 2500 transzduktánst szúrunk fel a lemezekről és helyezünk el 96 üreges mikrotitráló lemezeken, egy telepet egy üregbe, a lemez TY tápközeget tartalmaz 100 pg/ml ampicillinnel. A mikrotitráló lemezeket 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. Ezek a mikrotitráló lemezek szolgálnak a Streptomyces erythreus DNS genetikai könyvtárának mintalemezeiként, ezeket -4 °C hőmérsékleten tároljuk a kísérlet további időtartamán át. 3. példa Nitrocellulóz lemezek készítése hibridizáláshoz A Streptomyces erythreus genetikai könyvtár -2500 egyedi izolátumát tartalmazó 26 mikrotitráló lemezt replika-lemez eljárásnak vetjük alá nitrocellulózra, párhuzamos mintával. Mindegyik lemezt egyenként vetünk alá replika-lemez eljárásnak egy nitrocellulózdarabra, amelyet ezután szűrőnek nevezünk. A szűrőket úgy jelöljük meg, hogy lehetséges legyen megmondani, a szűrőt melyik mintalemezről vettük, és a szűrő iránya milyen a mintalemezhez viszonyítva, amelyről ezt készítettük. A szűrőket ezután elhelyezzük a transzduktánsokat tartalmazó oldalával felfelé, TY agar lemezekre, amelyek 100 pg/ml ampicillint tartalmaznak, és a lemezeket, amelyekre a szűrőket elhelyeztük, 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A következő reggelen a szűrőket 05 mól/1 NaOH- val telített itatós papírra helyezzük 5 percre. Miután a szűrőket szárazra itattuk, ezt az 5 perces inkubálást 0,5 mól/1 NaOH-val telített itatóspapíron megismételjük. A szűrőket ismét szárazra itatjuk, majd további 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
