202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 A jelen találmány antibiotikum bioszintetizáló gének izolálási eljárásaival, egy antibiotikum bioszintetizáló géneket tartalmazó plazmiddal, és az ezt a plazmidot tartalmazó sejtekkel foglalkozik. A jelen eljárás akkor a leghasznosabb, amikor olyan antibiotikum bioszintetizáló utak izolálásához alkalmazzuk, amelyek egy szóban forgó antibiotikum bioszintéziséhez szükséges antibiotikum-bioszintetizáló-gének teljes készletét jelentik. Az antibiotikum-bioszintetizáló-géneket lehet alkalmazni antibiotikum termelés növelésére, új antibiotikumok előállítására, és más antibiotikum-bioszintetizáló-gének izolálására. A jelen módszer különösen hasznos Streptomycesből származó antibiotikum bioszintetikus gének izolálásában. A Streptomyces az az organizmus-csoport, amely a klinikailag jelentős antibiotikumok több, mint felét szolgáltatja. A Streptomyces így létrejött kereskedelmi-ipari fontossága miatt sok időt és erőfeszítést fordítottak a Streptomyces genetikájának tanulmányozására és a Streptomyces klónozó vektorok és transzformációs rendszerek kifejlesztésére. Következésképpen elég sokat tudunk már a Streptomyces-ről, és számos klónozó vektor létezik az organizmusok transzformálásához. A rekombináns-DNS technológiai módszerei azonban még nem alkalmazhatók könnyen a Streptomyces-hez az antibiotikum bioszintetizáló gének izolálásának nehézségei miatt. Ezzel ellentétben a jelen találmány új módszert nyújt, amely nagy lökést fog jelentem az antibiotikumok előállítására fermentációs úton. A jelen módszer felhasználja az antibiotikum rezisztencia átadó gének összekapcsolását az antibiotikum bioszintetizáló génekkel. A kapcsolás áthidalja a távolságot két vagy több gén között. Az összekapcsolást az antibiotikum bioszintetizáló és rezisztencia átadó gének között fel lehet használni az antibiotikum-bioszintetizáló-gének izolálására az antibiotikum termelő organizmusok javítása céljából vagy új antibiotikumok előállítása céljából. A jelen találmány előtt nehéz volt antibiotikum bioszintetizáló géneket izolálni. A technika eddigi állása szerinti módszerek azt követelik, hogy mutánsok különböző készleteit alkossák meg az antibiotikum-termelő organizmusokból, amelyekből az antibiotikumbioszintetizáló-géneket izolálni szándékoznak. A mutánsoknak, amelyeket „blokkolt mutáns”-oknak hívnak, hiányosnak kell lenniük egy antibiotikum bioszintetizáló génre. Ezeket a mutánsokat nehzéz izolálni és jellemezni. Amikor a mutánst kinyerik, ezeket genetikai „könyvtár”-okból származó klónozott DNS-sel transzformálják, és a transzformánsokat elemzik, hogy meghatározzák, vajon a „blokk mutáns” kiegészült-e a DNS transzformálásával. Az eljárás időt rabló, mivel minden egyes transzformánst át kell vizsgálni enzimaktivitásra vagy antibiotikum-termelésre, mivel nincs más módszer annak eldöntésére, hogy a genetikai könyvtár rekombináns vektorai rendelkeznek-e azzal a DNS szegmenssel, amely tartalmaz egy antibiotikum bioszintetikus gént. A jelen találmány olyan eljárás, amely antibiotikum-rezisztenciát átadó géneket alkalmaz az olyan DNS szegmenseinek azonosítására, amelyek antibiotikum-bioszintetikus-géneket tartalmaznak. Több faj, amely termel antibiotikumokat, termel olyan enzimeket is, amelyek olyan reakciókat katalizálnak, amelyek rezisztenciát visznek át ezekre az antibiotikumokra. Antibiotikum rezisztencia- átvivő géneket izolálhatunk gén klónozással. így pl. egy olyan Streptomyces törzsből eredő DNS klónozása, amely egy adott antibiotikumot termel, egy olyan Streptomyces törzsbe, amely normálisan érzékeny erre az antibiotikumra, olyan transzformánsokat hozhat létre, amelyek tartalmazzák az antibiotikum rezisztenciát átadó gént. Az antibiotikum rezisztenciát átadó gént tartalmazó kiónt lehet izolálni az antibiotikumra való rezisztenciára szelektálva. A jelen módszer egyik kiviteli módja DNS nagy szegmensein levő antibiotikum rezisztencia átadó gének izolálásából áll, úgy, hogy a rezisztencia átadó génekhez kapcsolt antibiotikum bioszintetizáló gének szintén klónozva vannak. Nem minden antibiotikum bioszintetizáló gén izolálható a fentebb említett módszerrel az antibiotikumteimelő organizmusokból. Mégis az antibiotikum rezisztencia átadó gének és az antibiotikum bioszintetizáló gének összekapcsolását az esetek nagyobb részében lehet alkalmazni antibiotikum bioszintetizáló gének izolálására. A szerkezeti hasonlóság miatt, amely fennáll az antibiotikumok adott osztályának tagjai között, az antibiotikumok egy adott osztályához tartozó antibiotikum-rezisztenciát átadó gének gyakran hasonló DNS szekvenciával rendelkeznek és hasonló enzimaktivitást kódolnak. A hasonló DNS szekvencia miatt, amelyet homológiának is neveznek, egy adott osztály antibiotikumjaihoz tartozó antibiotikum-rezisztenciát átadó gént lehet alkalmazni olyan DNS szegmensek azonosítására, amelyek az azonos osztályba tartozó más antibiotikum-rezisztenciát átadó gént tartalmaznak. Ha a DNs szegmensek megfelelő méretűek, a rezisztenciát átadó génhez kötött antibiotikumbioszintetizáló-gének szintén azonosíthatók. A DNS szegmens lehet bármilyen ésszerű méretű, amely lehetővé teszi egy egyedi antibiotikum-bioszintetizálógén izolálását viszonylag kis szegmenssel, vagy egy teljes antibiotikum bioszintetizáló utat viszonylag nagy szegmenssel. Az antibiotikum-bioszintetizáló-gént tartalmazó DNS szegmenseket azután a szóban forgó organizmushoz szolgáló, rendelkezésre álló klónozó vektorok bármelyikébe lehet klónozni. A bioszintetizáló géneket sok kópiás vektorokba, pl. plazmidokba iktatva, és ezeket a vektorokat megfelelő gazdaszervezetbe bevezetve, amelyekből a géneket izoláltuk, megnövekedett antibiotikum termelés jöhet létre. Egy vektort, amely egy teljes antibiotikum bioszintetizáló utat tartalmaz, olyan gazdaszervezetbe bevezetve, amely nem termel antibiotikumot, de amely felismeri a bioszintetikus út génjeinek átírási és transzlációs kontroll szignáljait, antibiotikum termelés jöhet létre a transzformált gazdaszervezetben. Azonos vektort bevezetve olyan gazdaszervezetekbe, amelyek eltérő antibiotikumot ter5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
