202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 melnek ahhoz az antibiotikumhoz viszonyítva, amelyből a bioszintetizáló géneket izoláltuk, új antibiotikumok jöhetnek létre. A jelen találmány céljaira, amelyet itt bemutatunk és amelyhez oltalmat kérünk, a következő kifejezéseket definiáljuk az alábbiakban: AmR - az apramicin rezisztencia átadó gén. Antibiotikum - mikroorganizmusok által termelt anyag, amely vagy természetes formájában, vagy korlátozott kémiai módosítás után gátolja más mikroorganizmusok vagy eukarióta sejtek növekedését, vagy elpusztítja azokat. Antibiotikum bioszintetizáló gén - DNS szegmens, amely olyan enzimes aktivitást kódol, amely szükséges egy enzimes reakcióhoz a primer metabolitok átalakításának folyamatában antibiotikumokká. Antibiotikum bioszintetizáló út - a primer metabolitok antibiotikumokká való átalakításának folyamatához szükséges antibiotikum bioszintetizáló gének teljes készlete. Antibiotikum-termelő organizmus - bármilyen organizmus, beleértve (de nem csak ezekre korlátozva) az Actinoplanest, Actinomadurát, Bacillust, Cephalosporiumot, Micromonospórát, Penicilliumot, Nocardiát és Streptomycest, amely vagy egy antibiotikumot termel, vagy egy olyan gént tartalmaz, amely, ha kifejeződne antibiotikumot termelne. Antibiotikum rezisztenciát átadó gén - olyan DNS szegmens, amely egy enzimes vagy más aktivitást kódol, amely egy antibiotikumra való rezisztenciát ad át. ApR - az ampicillin rezisztencia átadó gén. Kétfunkciós ingázó klónozó vektor - rekombináns DNS-t klónozó vektor, amely replikálódni és/vagy integrálódni képes két különböző rendbe tartozó organizmusban. Klónozás - egy DNS szegmens beépítésének folyamata egy rekombináns DNS klónozó vektorba, és egy gazdasejt transzformálása a rekombináns DNS-sel. cos - a lambda kohézív végszekvencia. kozmid - rekombináns DNS klónoző vektor, amely nem csupán replikálódik egy gazdasejtben azonos módon, mind egy plazmid, hanem be is van csomagolva fág-fejekbe. EryR - az eritromicin rezisztenciát átvivő gén. Genetikai könyvtár - rekombináns DNS klónozó vektorok készlete, amelybe egy adott organizmus lényegében összes DNS-ét tartalmazó szegmensek vannak klónozva. Hibridizálás - két egyszálú DNS molekula összeforrasztásának folyamata kétszálú DNS molekulává, amely lehet teljesen bázis- páros, vagy nem. NmR - a neomicin rezisztencia átadó gén. őri - egy plazmid replikációs origó. Rekombináns DNS klónozó vektor - bármilyen autonóm módon replikálódó vagy integrálódó ágens, beleértve (de nemcsak erre korlátozva) a plazmidokat, amelyek olyan DNS molekulát tartalmaznak, amelyekhez egy vagy több további DNS molekulát lehet hozzáadni, vagy egy vagy több DNS molekula van már hozzáadva. Restrikciós fragmens - bármilyen lineáris DNS molekula, amely egy vagy több restrikciós enzim működése révén jön létre. rRNS - riboszomális ribonukleinsav. Érzékeny gazdasejt - olyan gazdasejt, amely nem tud nőni egy adott antibiotikum jelenlétében egy olyan DNS szegmens nélkül, amely erre rezisztenciát ad át. Str őri - Streptomyces plazmid replikációs origó. Transzduktáns - befogadó gazdasejt, amelyet rekombináns fágfertőzés útján végzett transzformálásnak vetettek alá. Transzformáns - befogadó gazdasejt, amelyet transzformációnak vetettek alá. Transzformáció - olyan DNS bevezetése egy befogadó gazdasejtbe, amely megváltoztatja a genotípust és változásokat eredményez a befogadó sejtben. Az alábbiakban megadjuk az ábrák rövid ismertetését: Az 1. ábra a pKC462A plazmid restrikciós hely és működési térképe. A 2. ábra a pKC488 plazmid restrikciós hely és működési térképe. Az alábbiakban ismertetjük a találmány részletes leírását. A jelen találmány eljárás antibiotikum bioszintetizáló gének azonosítására és izolálására, amely a következőkből áll: 1. kromoszomális és plazmid DNS izolálása egy antibiotikumtermelő organizmusból; 2. az izolált kromoszomális és plazmid DNS genetikai könyvtárának elkészítése olyan módon, hogy a könyvtár mindegyik rekombináns vektora egy 1-45 kb közti méretű DNS fragmenst tartalmaz; 3. egy antibiotikum rezisztenciát átadó gén hibridizálása a könyvtárhoz; 4. annak azonosítása, hogy a könyvtár melyik rekombináns DNS klónozó vektora hibridizálódik a rezisztencia átadó génhez; és 5. a hibridizált vektorok izolálása a könyvtárból. A jelen módszer öt lépésének mindegyikét később részletesebben leírjuk. A jelen módszer 1. lépése kromoszomális és plazmid DNS-ek izolálását igényli egy antibiotikum-termelő organizmusból. Streptomyces kromoszomális és plazmid DNS-ek izolálásához szolgáló módszerek sokasága ismert a szakterületen; egy ilyen példát mutatunk be alább az 1. példában. Az 1. példa módszere általában alkalmazható minden antibiotikum-termelő organizmushoz, bár kisebb módosítások, mint pl. az inkubálási időben vagy reakciótérfogatban szükségesek lehetnek az eljárás optimalizálásához egy adott mikroorganizmusoknál. Antibiotikum-termelő organizmusok széles választékát, valamint az ilyen organizmusok által termelt antibiotikumok széles választékát mutatjuk be az alábbi I-IX. táblázatokban. A jelen módszer alkalmazható az alábbi táblázatokban felsorolt összes organizmusokhoz, de nem csak ezekre korlátozódik. (Chemistry and Biology, of beta-lactam Antibiotics, Eds. Robert B. Morin & Marvin Gorman, Academic Press, 1982, New York.) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
