202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202923 B 2 nyiségét a TCA-ban (triklórecetsavban) oldhatatlan radioaktivitás meghatározásával állapítjuk meg. Egyetlen reagáltatás 200-300 ng egyszálú cDNS-t eredményez. A második szál szintézise érdekében az egyszálú cDNS-t centrifugálással ülepítjük, egyszer mossuk 80%-os etanollal, szárítjuk, majd megfeleld mennyiségű desztillált vízben feloldjuk. A szimpla szálú DNS (sscDNA) dupla szálú DNS-sé (dscDNA) való konvertálásához 500 ng sscDNA-t lehet 100 pl reakciótérfogatban feldolgozni. A reakcióelegy összetétele a következő: 20 mM trisz.HCl (pH-7,5), 5 mM MgCh, 10 mM (NH4)2SC>4, 100 mM KC1, 0,15 mM béta- NAD, 50 pg/ml 1BSA, 40 pM a dNTP-kből, 8 E/ml E.coli RNázH (BRL), 230 E/ml DNS polimeráz I (New England Biolabs) és 10 E/ml E.coli DNS-ligáz (New England Biolabs). A reakcióelegyet 60 percen át 12 °C-on, majd ezután 60 percen át 22 °C-on inkubáljuk. A reakciót EDTA hozzáadásával - 20 mmól végkoncentrációig - állítjuk le. A dscDNA-t PCI-vel extraháljuk és mint fent, kicsapjuk [U. Gubler és BJ. Hoffmann, Gene, 25, 263-269 (1983)]. b) A duplaszálú DNS klónozása Egy alacsony transzformációs tulajdonságú klónozó vektort a következőképpen állítottunk elő: 300 pg pUC9 plazmid DNS-t [Gene, 19,259-268 (1982)] PstI restrikciós endonukleázzal teljesen megemésztünk. A megemésztett plazmid-DNS-t agaróz-gél elektroforézissel tisztítjuk, elektroeluáljuk és etanollal kicsapjuk. Az agaróz-gél elektroforézissel tisztított vektor a transzformációs kísérletekben mintegy 1-2 telepet ad ng-onként, míg szuperspiralizált pUC9-cel a transzformáció aránya körülbelül 2.000-4.000 telep a plazmid DNS 1 ng-jára számítva. Az ilyen módon előállított pUC9 plazmid DNS-el, 50 pl reakció-térfogatban, homopolimer-tailing-et (homopolimer farok ráépítést) végzünk. A reakció elegy öszetétele a következő: 100 mM kálium-kakodilát (pH=7,5), 2 mM C0CI2, 0,2 mM DTT, 0,9 mM dCTP, 5 pCi (5-3H)-dCTP (19 Ci/mmól, Amersham TRK.352), 5 mg/ml BSA, 28 pg Pstl-gyel hasított pUC9 plazmid-DNS és 45 egység terminális transzferáz (P- L Biochemicals). A reakcióelegyet 5 percig 22 °C-on inkubáljuk és a reakciót 50 pl 25 mmólos EDTA hozzáadását követően 15 percig tartó 70 °C-on való inkubálással állítjuk le. Ilyen feltételek mellett minden 3’ véghez 22 nukleotidot szintetizálunk, ez az a hosszúság, ami a maximális transzformációs rátához szükséges [S.L. Peacock, C.M. Mclver és J.J. Monahan, Biochim. Biophys. Acta, 655, 243-250 (1981)]. A kettős szálú DNS-nek dGTP-vel való homopolimer-farkazását azonos feltételek mellett végezzük, de a reakciónként a dscDNA mintegy 100 ng-ját 30 egység terminális transzferázzal reagáltatjuk 30 percig 37°C-on. A reakciót 50 pl 25 mmólos EDTA hozzáadásával és 15 percig 70 °C-on történő hőinaktiválással fejezzük be. A dGTP farokkal ellátott duplaszálú cDNS-nek a dCTP farokkal ellátott pUC vektorral való összakapcsolását 50 pl oldatban végezzük, mely 10 mM trisz.HCTt (pH-7,5), 1 mM EDTA-t és 150 mM NaCl-t tartalmaz. A reagáltatás 120 percig 58 °C-on történik. A duplaszálú cDNS és a vektor DNS közötti különböző arányokat arra használtuk, hogy megállapítsuk a duplaszálú cDNS beadagolt mennyiségével elérhető maximális klónszámot. A transzformálást CaCl2-vel és kompetens E. coli RRI sejtekkel [S.L. Peacock, C.M. Mclver és J.J. Monahan, Biochim. Biophys. Acta, 655, 243-250 (1981)] végezzük, azaz 100 pl sejtszuszpenziót 50 pl fenti reakcióeleggyel keverünk el, majd kikenjük 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB lemezekre. Azt az arányt, amelynél a legmagasabb transzformációs számot kaptuk, használjuk fel a cDNS génbank végleges megalapozása érdekében végzett „scale-up” kísérleteknél. A duplaszálú cDNS 50 ng-jának felhasználásával körülbelül 20.000 független telepet kaptunk. 5. példa Az U-937 cDNS génbank szűrése HLZ kiónokra a) Telep-hibridizálás Abból a célból, hogy a pozitív, azaz a teljes HLZ gént, vagy ennek egy fragmentumát tartalmazó transzformált sejtet kapjunk, először telep-hibridizációval szűrjük a génbankot. Azoknál a transzformált sejteknél, amelyek pozitívnek mutatkoznak, további szűrést végzünk „dot-blot” analízissel. A transzformált sejteket egy éjszakán át LB+ampicillin (50 pg/ml) lemezeken tenyésztjük 37 °C-on. A telepeket ezután nitrocellulóz membránokra (0,45 pm, Schleicher-Schüll) visszük át. Úgy a lemezeket, mint a szűrőket úgy jelöljük, hogy lehetőség legyen a pozitív transzformált sejtek azonosítására. A szűrőket gondosan ráhelyezzük a lemezekre, rajtahagyjuk 20 percig szobahőmérsékleten, majd levesszük és 0,5 n NaOH/1,5 M NaCl-el telített 3MM szűrőre (3MM Chr, Whatman) helyezzük őket (a telepek felül legyenek). A NaOH feleslegének eltávolítására a nitrocellulóz szűrőket 15 percig tartó inkubálás után száraz 3MM szűrőre visszük át, majd 3 percre olyan 3MM szűrőre, amelyet előzőleg 1 mólos trisz.HCl (pH-7) 1,5 mólos NaCl oldatával itattunk be. A szűrőket ezután 20 másodpercre 3* SSC oldatba merítjük, levegőn megszárítjuk és 80 °C-on 2 órán át hevítjük. Az ilyen módon kezelt szűrőket egy éjszakán át 65 °C-on lassú rázogatás mellett előmossuk 3* SSC pufferben, amely 0,1% SDS-t (Serva) és 10 mM EDTA-t tartalmaz. A puffert néhányszor cseréljük. Az előmosást akkor tekintjük befejezettnek, ha már nem találhatók a szűrőkön baktérium telepeknek tűnő nyomok sem. Közvetlenül a mosás után a szűrőket előhibridizáljuk a kővetkező összetételű oldatban: 6* SSC, 1* Denhardt oldat, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturált burjú timusz DNS (Sigma), 0,05% nátrium-pirofoszfát. A szűrőket 37 °C- on 3 órán át inkubáljuk és ezután egy éjszakán át 37 °C-on y-32P-ATP-vel jelzett EÍ-ON19 17merrel hibridizáljuk. A hibridizáló oldat tartalma a következő: 6* SSC, 1* Denhardt oldat, 20 pg/ml élesztő tRNS (XX típus, Sigma), 0,05% nátrium-pirofoszfát és polinukleotid kináz révén végén jelzett 17mer EÍ-ON19. A nukleotid kináz reakciót a 3. példában már leírtuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
