202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 Hibridizálás után a szűröket 0,05% nátrium- pirofoszfát tartalmú 6* SSC pufferben mossuk a következőképpen: 3*5 percig szobahőmérsékleten, 30 percig 37°C-on, 10 percig 47 'C-on és 10 percig 53 'C-on (fakultatív). A szűrőket ezután levegőn megszárítjuk, majd röntgen filmre (X-Omat RP, Kodak) exponáljuk Dupont erősítő szűrő (Dupont intensifying screen) segítségével 24 órán át -70 'C-on. A filmek előhívása után 48 telepet választottunk ki a további vizsgálatra (dot-blot analízis); ezek a telepek a háttérrel szemben kétségtelenül erősebb jeleket adtak. b) Dot-blot hibridizáció A 48 kiválasztott teleppel beoltunk 30 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajból 2 ml-es mintákat. A tenyészeteket egy éjszakán át 37 'C-on, erős rázás mellett tenyésztjük. A DNS-eket Bimbóim és Doly módszerével [H.C. Bimbóim és J. Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979)] izoláljuk. Minden egyes DNS preparátumot feloldunk 67,5 pl vízben, hozzáadunk 7,5 pl 4 n NaOH-t, majd az anyagot 1 órán át 65 °C-on vízfürdőben inkubáljuk. A mintákat jégen lehűtjük és egymás után 20 pl 1,5 n HCl-t és 195 pl 2* SSC puffert adunk hozzájuk. Minden minta összmenynyisége 290 pl lesz. Bio-Dot készüléken (Bio-Rad) 145 pl-es adagokat szűrünk át úgy, hogy a DNS-eket két nitrocellulóz szűrőre fixálhassuk. A szűrés előtt a nitrocellulóz szűrőket 20 percig 2* SSC-ben áztattuk. Szűrés után a szűrőmembránokat levegőn szárítjuk és 2 órán át 80 °C-on hevítjük. Az egyik szűrőmembránt y-32P-ATP-vel jelzett EÍ-ON19 17mer oligonukleotiddal, a másikat y-32P-ATP-vel jelzett EÍ-ON20 17merrel hibridizáljuk. A hibridizáció és a mosás feltételeit az 5.a) példában írtuk le. A szűrőket Kodak X- Ómat RP röntgen filmre exponáljuk 6 órán át -70 'C-on. Hat pozitiven hibridizáló kiónt kaptunk, ezeket azonosítottuk és az eredeti transzformált sejteket pHL2, pHL8, pHL14-l, pHL21, pHL23, illetve pHL35 jelzéssel láttuk el. A kiválasztott kiónokban lévő cDNS inszertumok nagyságát restrikciós analízissel határoztuk meg. Az illető kiónok DNS-ét, melyet Bimbóim és Doly módszerével izolálunk, BamHI-gyel és Hindül-mal emésztjük, majd egy 0,8%-os agaróz-minigélben 4 órán át (150 V mellett) elválasztást végzünk. A pHL14-l, pHL21 és pHL23 plazmidok 500 bp hosszú inszertumot tartalmaztak. A pHL2 és pHL8 inszertumai 300 bp hosszúak voltak. 6. példa A HLZ-cDNS (HL14-1 klón) szerkezete és DNS szekvenciája A pozitív kiónok egyikét (5. példa), melyet HL14- 1-nek neveztük el és amely egy körülbelül 500 bp hoszszú inszertumot tartalmaz, részletes analízisre választottuk ki. A HLZ-cDNS szerkezetét a 3.a) ábra ábrázolja. A pHL14-l plazmid DNS-ének 20 pg-ját teljesen megemésztjük BamHl és Hindlll restrikciós endonukleázzal, az 5’ végeket y-32-P-ATP-vel jelezzük (3.b példa), majd egy második endonukleázzal hasítjuk. Az egy helyen jelzett DNS fragmentumokat poliakrilamid- és agaróz-gél elektroforézissel különítjük el. A jelzett DNS fragmentumokat elektroelúcióval izoláljuk és Maxam és Gilbert módszerével [A.M. Maxam és W. Gilbert, Methods Enzymol., 65, 498-560 (1980)] szekvenáljuk. A 3lb árbán a felső nyilak mutatják az ezzel a módszerrel végzett szekvencia analízis irányát és kiterjedését; a csillagocskák a radioaktív helyeket jelzik. A pHL14-l cDNS belső részét Sanger módszerével [F. Sanger, S. Nicklen és A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5467 (1977)] szekvenáltuk. A pHL14-l plazmid HLZ-cDNS-t tartalmazó BamHI-HindllI restrikciós fragmentumát részlegesen emésztjük Mnll restrikciós endonukleázzal, a fragmentumokat Maniatis módszere szerint [T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] tompa végekkel látjuk el Klenow polimeráz segítségével, majd beklónozzuk a Smal-gyel hasított M13 mp9 vektorba. Mind az M13- mal végzett minden DNS-manipulációt, mind a szekvenálást pontosan az Amersham brossurában („Ml3 cloning and sequencing handbook”) (Order No. N.4502) leírt módszerek szerint végeztük. Azokat a restrikciós fragmentumokat, amelyeket ezzel a módszerrel klónoztunk és szekvenáltunk, a 3/b ábra mutatja be (alsó nyilak). A HL 14-1 kiónban csak a fontos restrikciós helyek pozícióit jelöltük meg. Az Mnll, MaelII és HinfI endonukleáz felismerő helyek jelenlétét kísérletileg bizonyítottuk. A DNS szekvenálás eredménye a 4. ábrán látható. A 20. nukleotidtól felfelé, a HLZ-cDNS szekvenciának nyitott leolvasási szerkezete van. A 62-451. nukleotid pontosan megfelel a humán lizozim aminosav szekvenciájának (5. ábra), melyet a TAA transzlációs terminátor kodon követ. A 20-61. nukleotid 14, főleg hidrofób aminosavat kódolt, s ezek a következők: 5’ De Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val Gin Gly Lys Val és így tovább. E nukleotidok a HLZ vezér- vagy szignál-peptidjének egy részét kódolják, ahogyan ez más szekretált proteineknél hasonlóképpen megtalálható [V.R. Lingappa és G. Blobel, Recent Prog. Horm. Res., 36, 451-475 (1980)]. A humán prelizozimben a kapcsolódási helyen („splice junction”) lévő aminosavak összetétele nagyon hasonló a tyúk tojásfehérje-lizozim ezen helyének aminosav összetételével (humán prelizozimben: Gin Gly Lys Yal; tyúk tojásfehérje-lizozimben: Leu Gly Lys Val; L.S, Weisman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 2306-2313 (1986)]. 7. példa A pHLl4-23 plazmid szerkesztése A HLZ előállításához szolgáló expressziós plazmid szerkesztésénél a HLZ inszertum leghosszabb 5’ végét (HL14-1 klón, pHL14-l plazmid) a HLZ inszertum leghosszabb 3’ végével (HL23 klón, pHL23 plazmid) - 5.b) példa - kombináljuk. A pHL23-ban a HLZ-DNS 3’ végének a szekvenciája a következő; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
