202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 MgCb, és 50 mmól NaCl tartalmú oldatban, majd a NaCl koncentrációt 150 mmól-ra emeljük és hozzáadjuk a Sall-et], így a pWS212D-ből kihasított HLZ gént, mint Hindül/Sall fragmentumot (körülbelül 500 ng, amelyet 1%-os agaróz gélből izolálunk a fent leírtak szerint) a HindlII/Sall-gyel kinyitott vektorba (körülbelül 50 ng) építhetjük be (a ligáz reakciót a 7. példában írtuk le). Az így kapott pWS231D plazmidban a HLZ gén most a megfelelő orientációban helyezkedik el az a- faktor promoterhez és terminátorhoz viszonyítva. c) Egy PstI hely eltávolítása az a-faktor génből Az a-faktor génben két PstI hely van. Az a hely, amelyik nem a kódoló szakaszon belül helyezkedik el, a további szerkesztést nagyon akadályozza és így a következő eljárással távolítjuk el: a pWS203D plazmidot (szerkesztését lásd a 9.a példában) Pstl-gyel részlegesen hasítjuk úgy, hogy 10 pg pWS203D-t emésztünk 36 “C-on 10 percig 10 egység Pstl-gyel 50 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 10 mM MgCl2-t és 50 mM NaCl-t tartalmazó oldatban. Azokat a fragmentumokat izoláljuk 1%-os agaróz gélből, amelyekben pontosan egy hasítás jött létre (a 14. a ábrán a B és C fragmentum). A pWS230-ből így kapott linearizált DNS-ek 3’-túllógó végeinek elemésztésére mung bean nukleázt (arany paszuly csíra nukleáz) használunk úgy, hogy a DNS 1 jxg-ját 13 pl vízben vesszük fel, majd hozzáadunk 2 pl 10 mmólos ZnCb-t, 1 pl 4 mólos NaCl-t, 2 pl 0,3 mólos nátrium-acetátot (pH-4,75) és 2 pl mung bean nukleázt (300 egység, Pharmacia). Ezt az elegyet 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ezután közvetlenül 1%-os agaróz gélre visszük fel, majd a fragmentumokat a gélből izoláljuk (Dretzen és munkatársai, lásd fent). Ezután következik a B és C fragmentum összekapcsolása (a feltételek azonosak a 7. példában leírtakkal), amikor is azok a PstI helyek, amelyek a részleges emésztésnél elhasadtak, megsemmisülnek és amelyek nem hasadtak el, megmaradnak. Ilyen módon egy olyan plazmidot izoláltunk, amely az illető PstI helyet már nem tartalmazta, de a másik megmaradt (C). Ezt a plazmidot (C’), valamint a pWS231D-t is Pstl-gyel és BglII-vel teljesen megemésztjük [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl; 36 *q. A C’-ből (körülbelül 50 ng) izolált C2-fragmentumot (850 bp) a Pstl/BglII- vei emésztett pWS231D plazmádba (körülbelül 50 ng) építjük be (a ligáz reakciót a 7. példában írtuk le), s így kapjuk a pWS294D plazmidot. Ez a plazmid most egy PstI hellyel rendelkező a-faktor gént tartalmaz, amelybe a HLZ gén 3’ vége a megfelelő orientációban van beépítve. d) Az expressziós kazetta megszerkesztése A pWS294D plazmid tartalmazza az a-faktor promoter! és az a-faktor peptid kezdetét a PstI hasítási helyig terjedően (körülbelül 20 bp hosszú vezér-peptid), valamint - ehhez kapcsolódva - a HLZ gén 3’ végét a PstI helytől a stop kodonig terjedően. A teljes expressziós kazettából hiányzik még az a-faktor vezérszekvencia 3’ vége, a HLZ gén 5’ vége, valamint az átmenet e két elem között. A pWS249D plazmidot (körülbelül 1 pg) Pstl-gyel teljesen megemésztjük [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCl2,50 mM NaCl; 36 °C] és az A2/25 plazmádból (8.c példa) való mutagén 440 bp hosszú PstI fragmentumot (körülbelül 500 ng) a 8.e példa szerint beépítjük ligáz segítségével a pWS294 PstI helyére. A kapott pWS296D elnevezésű plazmid tartalmazza azt az expressziós kazettát, amely az a-faktor gén 900 bp hosszú promoter szekvenciájából, a 260 bp hosszú a- faktor vezérszekvenciából (azonos a 8.e) példában leírt hosszúságú szekvenciával) és a 290 bp hosszú a-faktor terminátorból áll. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás humán lizozimot (HLZ) kódoló komplementer DNS (cDNS) előállítására, azzal jellemezve, hogy egy humán sejt izolált össz-DNS-éből elkülönítjük a poliA+mRNS-t, az így nyert izolátumból cDNS-t készítünk, a kapott kettős szálú cDNS klónozásával cDNS géntárat szerkesztünk, a kapott cDNS géntárat alkalmas oligonukleotidok segítségével végzett hibridizálással szűrjük, és a teljes humán lizozimot kódoló, adott esetben vezérszekvenciával ellátott cDNS-t izoláljuk, és kívánt esetben 5’-végéhez egy startkodont és 3’-végéhez egy stopkodont kapcsolunk. 2 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5’ATTGTTCTGGGGCTTGTCCTCCTTTCTGTTACGGTTCAAGGCAAGGTCTTTGAAA GGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGGCTACAGGGGAATCA GCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACACGAGCTA CAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACrGATTATGGGATATlTCAGATCAATAGCC GCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCCT GCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGGGTTG TCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTTGTCAAAACA GAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTGTAACTCCAGAATTTTCCTTCTT CAGCTCATTTTGTCTCTCTCACAATTAAGGGAGTAGGTTAAGTGAAAGGTCACATAC CATTATTTC és 17
