202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 5’AAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATG GCTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTT ACAACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATAT TTCAGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATG CCTGTCATTTATCCTGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCn' GTGCAAAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAA ATCGTTGTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTG. nukleotidszekvenciájú, humán lizozimot kódoló cDNS-t, vagy humán lizozimot kódoló allél-változatait 10 állítjuk elő. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypontban megadott szekvenciájú cDNS- ek egyikével több, mint 85% homológiát igénylő szigorúan meghatározott körülmények között hibridizáló 15 és humán lizozimet kódoló, adott esetben vezérszekvenciával ellátott cDNS-t állítunk elő. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szűrést az 20 5’ CC ^TC £tT qCACCA qTA 3’ és az A 25 5' Aq qCACATCCA qTT JgC 3’ G képletű oligonukleotidok segítségével végzett hibridizálással hajtjuk végre. 5. Eljárás humán lizozim aktív formában való előállítására transzformált élesztősejtben történő kifejezéssel, azzal jellemezve, hogy egy promoterből, transzlációs startkodonból, vezérszekvenciából, az 1-4. igénypontok szerint előállított cDNS- ek valamelyikéből és terminátorból álló expressziós plazmidot szerkesztünk, amellyel egy élesztősejtet transzformálunk, és a transzformált sejteket alkalmas táptalajban tenyésztjük, végül a táptalajból kinyerjük a képződött humán lizozimot. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ADHI- promoterből, ATP-startkodonból, a-faktor vezérszekvenciából, az 1-4. igénypontok szerint előállított cDNS- ek egyikéből és a-faktor terminátorból szerkesztünk expressziós plazmidot. 7. Az 5. és 6. igénypontok szerinti eljárás az Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Met Cys Leu Ala Lys Tip Glu Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Phe Gin Ile Asn Ser ARg Tyr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys Leu Gin Asp Asn Ile Ala Asp Val Val Arg Asp Pro Gin Gly Arg Asn Arg Cys Gin Asn Arg Gly Cys Gly Val 40 Leu Ser Val Thr Val Gin Gly Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Ser Gly TVr Asn Thr Arg Ala Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp Asp Val Arg Gin Tyr Val Gin aminosavszekvenciájú humán lizozim előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti aminosavszekvenciát kódoló cDNS-t használunk az expressziós plazmid szerkesztéséhez. 8. Eljárás humán lizozimot vagy annak egy alléi változatát kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns klónozó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1- 4. igénypontok szerint előállított cDNS-ek valamelyikét egy replikálható bakteriális plazmidba építjük be. 9. Eljárás aktív humán lizozim transzformált élesztősejtben való kifejezésére képes expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított cDNS-ek egyikét promoterrel, transzlációs startszignállal, vezérszekvenciával és terminátorral összekapcsolva rekombináns alkotórészként egy élesztővektorba visszük be. 10. Eljárás az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti előállított aktív humán lizozim szintetizálására képes gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy élesztősejteket egy 9. igénypont szerint előállítót expressziós vektorral transzformálunk. 45 50 18
