202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására

1

HU 202 923 B

2

A transzficiált DNS segítségével kapott 222 plakkból 84-et LB- lemezre viszünk át, ahol az inficiált baktériumokból telepek fejlődnek (37 °C, 16 óra). Egy „nitrocellulóz-blot”-ot készítünk és az EBI 124 32P-vel jelzett mutagén oligonukleotiddal szűrővizsgálatot végezünk. A nitrocellulóz szűrőt 6* SSPE-vel (0,9 M NaCl, 0,06 M NaH2P04, 6 mM EDTA) 5 percig szobahőmérsékleten előmossuk, hibridizáló pufferben [6* SSPE, 1% Sarkosyl (Sigma), 100 pg/ml alkalmilag hasított tRNS] 15 percen át 37 °C-on előhibridizáljuk és szobahőmérsékleten (22 °C) 16 órán át hibridizáló pufferben 0,4» 106 cpm/ml próba- anyaggal hibridizáljuk. A próba-anyagot 5’ végén y32P-ATP-vel jelezzük a következőképpen: az EBI124 mutagén primer 30 pmólját 4 egység T4 polinukleotid kinázzal (Biolabs) 20 pl 50 mM trisz.HCl (pH-7,6), 10 mM MgCb, 10 mM DTT, 1 mM Spermidin, 100 pg/ml BSA és 10 pmól y-32PATP (5.000 Ci/mmól, Amersham) tartalmú oldatban 37 °C-on 45 percig foszforiláljuk. A reakcióelegyet ezután Biogel P-6DG (Biorad) géllel, TE pufferben [10 mM trisz.HCl (pH-7,5), 1 mM EDTA] kromatográfiásan tisztítjuk, hogy elválasszuk a be nem épült y-32PATP-t a 32P-vel jelzett oligonukleotidoktól.

Hibridizálás után a szűrőket háromszor mossuk 6* SSC oldatban (0,9 M NaCl, 0,09 M nátrium-citrát) szobahőmérsékleten 5 percig és egyszer előmelegített 6» SSC oldatban 37, 47,5 50 és 56 °C-on 5-5 percig és minden mosás után autoradiográflás vizsgálatot végzünk. Az 56 °C-on (Td+2 °C) végzett autobiográfía egy olyan kiónt - A2/25 - mutatott ki, amely a mutagén oligonukleotiddel erősen hibridizált. A feltehetően mutáns fágot plakk módszerrel tisztítottuk, még egyszer szűrtük, hogy a tiszta mutáns fágot azonosítsuk, s hogy a deléciót igazoljuk, szekvencia analízist végeztünk.

Az A2/25 klón kétszálú DNS-ét Yanisch-Perron és munkatársai szerint [Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33, 103-119 (1985)] izoláljuk és Pstl-gyel hasítjuk [körülbelül 5 pg 50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCb és 50 mM NaCl tartalmú oldatban, 36 °C- on],

A 440 bp hosszú PstI fragmentumot, amely most már az a-faktor vezérszekvencia és az érett HLZ közt a kívánt átmenetet tartalmazza, 1%-os agaróz gélből izoláljuk (Dretzen és munkatársai szerint, lásd fent) és felhasználjuk az alábbiakban közelebbről megvilágított ligáz reakciókban (8.e és 9.d példa).

d) Az ADHII terminátor és a HLZ gén 3’ vége

Az ADHII terminátort [D.R. Beier, E.T. Young, Nature, 300, 724-728 (1982); D.W. Russel és munkatársai, J. Bioi. Chem., 258, 2674-2682 (1983)] a pA55 plazmidból olyan módon izoláljuk, hogy a pA55 5 pgját SphI/Xbal-gyel emésztjük [6 mM trisz.HCl

(pH-7,4), 6 mM MgCb, 150 mM NaCl, 1 mM DTT; 36 °C] és mint már leírtuk, 1%-os agaróz gélből izoláljuk. Az ADHII DNS szekvenciáját D.W. Russel és munkatársai (lárs fent) írták le. ApUC18 emésztését [J. Vieira és J. Messing, Gene, 19,259-268 (1982); Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33, 103-119 (1985)] Sphlgyel és Xbal-gyel végezzük a fent megadott feltételek mellett. Ezután az emésztett vektorból körülbelül 50 ng-ot és az ADHII terminátorból körülbelül 500 ng-ot (SphI/Xbai fragmentum) 20 pl reakcióelegyben, ligáz pufferben [66 mM trisz.HCl (pH-7,6), 6,6 mM MgCb, 10 mM DTT, 1 mM rATP] 1 egység T4 DNS ligáz segítségével 14 °C-on egy éjszakán át - összekapcsolunk. A kapott pWS213 plazmiddal E.coli HB101 sejteket transzformálunk. Minthogy a pHL14-23-ból származó HLZ-DNS a stop kodon után egy nem kódoló szakaszból még további nukleotidokat és egy 20 dC-dG párból álló területet tartalmaz, amelyek a cDNS előállítása során keletkeztek, ezeket eltávolítjuk. Ebből a célból a pHL 14-23-mat Maelü-mal emésztjük [20 mM trisz.HCl (pH-8,0), 6 mM MgCb, 350 mM NaCl, 1 mM DTT; 45 °C]. A kapott 280 bp hosszú fragmentumot pontosan a stop kodonban hasítjuk és így a HLZ gén 3’ végét tartalmazza.

A túllógó végeket Klenow polimerázzal töltjük be olyan módon, hogy a Maelü-mal hasított DNS körülbelül 0,5 pg-ját 25 pl ligáz-puffer összmennyiségében (lásd fent) 100-100 pM dATP, dTTP, dCTP és dGTP- vel és 1 egység Klenow polimerázzal reagáltatjuk 30 percig szobahőmérsékleten. Körülbelül 1 pg pWS213D-t Smal-gyel emésztünk [6 mM trisz.HCl (ph-8,0), 6 mM MgCb, 20 mM KC1] 36 °C-on és a pHL14-23 tompavégű Maeül fragmentumát (körülbelül 500 ng) a pWS213D (körülbelül 50 ng) Smal helyére kötjük be (a feltételeket fent leírtuk).

A keletkezett plazmidot, mely a HLZ gént az ADHII terminátorhoz viszonyítva a megfelelő orientációban tartalmazza, pSW235Dnek neveztük el. Ez a plazmid a HLZ gén 3’ végét tartalmazza a stop kodonig bezárólag és rögtön ezután az ADHII terminátort. A HLZ gén és az ADHII terminátor közt van még egy BamHI és egy Xbal hasítási hely, melynek a pUC18 plazmidból származnak. Minthogy a BamHI hely a további szerkesztéseknél zavar, eltávolítjuk. E célból a pWS235D-t BamHI-gyel hasítjuk 36 *C-on [6 mM trisz.HCl (pH-8,0), 6 mM MgCb, 150 mM NaCl, 1 mM DTT], a túllógó végeket Klenow polimerázzal betöltjük (lásd fent) és beépítünk egy Sall-linkert a már leírt feltételek mellett (8.b példa). A keletkezett plazmidot pWS257D-nek neveztük és ezzel transzformálunk E.coli HB101 sejteket. A HLZ gén 3’ vége és az ADHII terminátor 5’ vége között lévő összekötő szekvencia szerkezete tehát a következő:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

5’ HLZ - GTAAC GGG GGATC GGTCGACC GATCC TCTAGA - ADHII-T 3’

CATTG CCC CCTAG CCAGCTGG CTAGG AGATCT - 1 2 3 4 5 6

1 - a HLZ 3’ vége Maelü-mal emésztve és Klenow 2 - a Smal klónozó hely maradék része (pWS213D)

polimerázzal betöltve, a TAA stop kodonnal együtt 60

14