202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 3 - kinyitott és Klenow polimerázzal betöltött Bam- HI hely 4 - Sall-linker (New England Biolabs) 5 - a 3-as pont alatt említett BamHI hely (kinyitott és Klenow polimerázzal betöltött) másik vége 6 - Xbal hely és az ADHÜ-terminátor startja. e) Az expressziós kazetta szerkesztése A 8.b példa szerint szerkesztett pWS2l5D plazmidot (körülbelül 1 pg) Pstl-gyel és HindlII-mal emésztjük (a feltételeket lásd a 8.a példában), miáltal a kapott 4,2 kb nagyságú fragmentummal kihasítottuk a teljes HLZ gént, valamint az a-faktor vezérszekvenciának nagy részét. Ugyanilyen feltételek mellett emésztjük Pstl-gyel és HindlII-mal a pWS257D-t és a kapott ADHII-teiminátort és a HLZ gén 3’ végét magában foglaló fragmentumot ligáz segítségével beépítjük a Pstl/HindlII helyre. A ligáz reakciót úgy végezzük mint fent (8.d példa). A kapott pWS218D plazmidban éppen az a-faktor vezérszekvencia kezdeténél van a HLZ gén 3’ vége, amely a stop kodonnal végződik és ehhez kapcsolódik az ADHII terminátor. Az expressziós kazetta elkészítéséhez hiányzik még az afaktor vezérszekvenciának egy nagy része és a HLZ gén 5’ vége, valamint két elem közötti korrekt átmenet. Ennek érdekében a 8.c példa szerint előállított mutagénezett 440 bp hosszú PstI fragmentumot (körülbelül 500 ng) a pWS218D (körülbelül 50 ng) PstI hasítási helyére kapcsoljuk be a fent leírt feltételek mellett. A plazmidot, amely a 440 bp hosszú PstI fragmentumot [a HLZ gén 5’ vége és az a-faktor vezérszekvencia nagy része (3’ vége)] a megfelelő orientációban tartalmazza az ADHI pormoterhez, illetve a HLZ gén 3’ végéhez viszonyítva, pWS290D-nek neveztük el. Ezzel a pWS290D plazmid az összes leírt elemet a megfelelő sorrendben és egymáshoz viszonyítva a helyes irányítottsággal tartalmazza, valamint a módosított, egzakt átmeneteket az egyes elemek között: 1450 bp ADHI promoter, 260 bp a-faktor vezérszekvencia (olyan szekvenciával végződik, mely egy proteáz hasítási helyet kódol), 390 bp HLZ gén (lizin kodonnal kezdődik, melyet az érett HLZ-t meghatározó szekvencia követ és a HLZ gén stop kodonjával végződik), 330 bp ADHII terminátor. f) A HLZ kifejeződése élesztőben A pWS290D expressziós kazetta 5 pg-ját HindlII- mal és BamHI-gyel emésztjük 36 *C-on [50 mM trisz.HCL (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl] és beépítjük az ugyancsak Hindm-mal és BamHI-gyel hasított sokmásolatú pJDB207 vektorba (1 jig). Mind a pWS290D expressziós kazettát (5 ng), mind a pJDB207 sokmásolatú vektort [1 pg; J.D. Beggs: Gene cloning in yeast, R. Williamson: „Genetic Engineering” c. kiadványának 2. kötetének 175-203 oldalain, kiadó: Acadamic Press, London (1981); DSM 3181] HindlII-mal és BamHI-gyel emésztjük 36 °C-on [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl]. Az ilyen módon kinyitott pJDB207 sokmásolatú plazmidba (körülbelül 50 ng) beépített az izolált Hindm/BamHI fragmentumot (körülbelül 500 ng) ligáz segítségével (20 pl ligáz-pufferes reakcióelegy 1 egység T4 DNS ligázzal, a feltételeket lásd a 7. példában). Ezzel a plazmiddal - 129/29 - különféle, különböző telepi! Saccharomyces cerevisiae élesztő törzseket transzformálunk [J.D. Beggs, Nature, 275, 104- 109 (1978)]: YPD táptalajban (1% Bacto élesztő kivonat, 2% Bacto pepton, 2% glükóz) egy éjszakán át tenyésztett előtenyészetből beoltunk 50 ml YPD táptalajt úgy, hogy sűrűsége 107 sejt/ml legyen, majd 2 generációt tenyésztünk 28 'C-on (általában 3 óra). A táptalajt 5.000 ford/perc mellett lecentrifugáljuk, a sejteket 5 ml SED-ben [1 M szorbit, 25 mM EDTA (pH-8,0), 50 mM DTT] reszuszpendáljuk és 30 ’C-on 10 percig lassan rázzuk. A szuszpenziót 1.600 ford/perc mellett lecentrifugáljuk, az üledéket 5 ml SCE-ben [1 M szorbit, 0,1 M trinátrium-citrát (pH-5,8), 10 mM EDTA] reszuszpendáljuk, kiveszünk belőle 100 pl-t és 2,9 pl vízben szuszpendáljuk. A szferoplasztok kialakulását 600 nm-en mérjük. Ezután 50 pl Glusulase-zal (ßglükuronidäz/szulfatäz márkanév) való kezelés következik lassú rázogatás mellett 28 *C-on. Különböző időközönként megint 100 pl szferoplaszt mintákat veszünk, 2,9 ml vízben szuszpendáljuk, s az extinkciót 600 nm-en megmérjük. Ahogy az extinkció (600 nm-en mért) a kiindulási érték 30%-ára csökken (általában 20-30 perc múlva), a sejteket 1.600 ford/perc mellett lecentrifugáljuk (asztali centrifugán). A szferoplasztokat egyszer mossuk 5 ml CaS oldattal [1 M szorbit, 10 mM CaCh, 10 mM trisz.HCl (pH—7,5)], megint lassan lecentrifugáljuk és 0,5 ml CaS oldatban veszünk fel. A szferoplasztokból alikvot mennyiségeket veszünk ki, 1 pg plazmid DNS- t (129/29) adunk hozzá (ha nagyobb mennyiségű a DNS oldat, úgy szorbit koncentrációját 1 M-ra kell beállítani), 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 1 ml PEG-es oldatot [20% (tömeg/térf) PEG 4.000,10 mM CaCh, 10 mM trisz.HCl (pH-7,5); sterilre szűrve] adunk hozzá. A reakciókeveiéket 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, 1.600 ford/perc mellett lecentrifugáljuk (asztali centrifugán), az üledéket 150 pl SOS oldatban [1 M szorbit, 33% (térfrtérf) YPD, 65 mM CaCl2, 13,5 pg annak az aminosavnak a steril oldatából, amire nézve a szelekciót végezzük] reszuszpendáljuk és 20 percig 30 °C-on állni hagyjuk. Ezt a keveréket 3 ml 45 ’C-ra lehűtött „top”-agarban [1 M szorbit, 2,5% agar, 0,67% BYNB (Bafto Yeast Nitrogén Base) aminosavak nélkül, 2% glükóz, 1% 100« aminosav keverék] könnyedén összerázzuk, majd agarlemezre (2% agar, 0,67% BYNB, 2% glükóz és annyi az aminosav-keverékből, mint a „top”-agarban) öntjük és 2-4 napig 30 ’C-on tenyésztünk. A 100*-aminosav-keverék -leu 2-2 g/l-t tartalmaz az alábbi anyagokból: adenin-szulfát, aiginin, uracil, asparagin, glutamin, hisztidin, metionin, lizin, tirozin, fenil-alanin, valin, treonin, triptofán. A transzformált S.cerevisiae élesztő törzseket SC -leu táptalajon (0,67% BYNB, 5% glükóz, 1% 100*- aminosav-keverék -leu) tenyésztjük 30 'C-on. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
