202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 PstI 10 20 30 40 GACTGCAGTG CTTTGCTGCA AGATAACATC GCTGATGCTG 50 60 70 80 TAGCTTGTGC AAAGAGGGTT GTCCGTGATC CACAAGGCAT 90 100 110 120 TAGAGCATGG GTGGCATGGA GAAATCGTTG TCAAAACAGA MaelII 130 140 150 160 GATGTCCGTC AGTATGTTCA AGGTTGTGGA GTGTAACTCC 170 180 190 200 AGAATTTTCC TTCTTCAGCT CATTTTGTCT CTCTCACAAT MaelII 210 220 230 240 TAAGGGAGTA GGTTAAGTGA AAGGTCACAT ACCATTATTT 250 260 CGGGGGGGGG GGGGGGGGGG 3’ A PstI helyig tartó 5’ vég (4. ábra) szekvenciája megfelel a pHL14-l DNS szekvenciájának. ApHL23- ból körülbelül 1 pg-ot Pstl-gyel és HindlII-mal emésztünk 36 “C-on [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl], majd 1%-os agaróz gélben elválasztást végezünk. Az egaróz gélből Dretzen módszerével [G. Dretzen és munkatársai, Anal. Biochem., 112, 295-298 (1981)] egy 260 bp hosszú Pstl-HindlII fragmentumot izolálunk, amely a HLZ strukturális génjének 3’ végét foglalja magába. Ezt a fragmentumot (körülbelül 500 ng) bekapcsoljuk a pHL14-l plazmidba (körülbelül 50 ng), miután a pHL14-l-ból a 190 bp hosszú Pstl/Hindffl fragmentumot eltávolítottuk. A DNS bekapcsolása 14 'C-on, egy éjszakán át, 20 pl ligázpufferben [66 mM trisz.HCl (pH-7,6), 6,6 mM MgCU, 10 mM DTT, 1 mM rATP] történik, 1 egység T4 DNS ligáz segítségével, majd e ligázos keverékkel kompetens E.coli HB101 sejteket transzformálunk ismert módszerrel [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 220. oldal (1982)]. 8. példa ADHI-promoter által szabályozott expressziós kazetta szerkesztése a) Az ADHI promoter és az a-faktor vezérszekvencia összekapcsolása (7. ábra) Kiindulási anyagként a pES103 plazmidot-pUC18 származék - használjuk, amely az ADHI promotert egy 1,5 kb hosszú BamHI/XhoI fragmentumként tartalmazza. A pES103 helyett az YEpl3-at (ATCC letéti száma 37.115) is használhatjuk azonos módon [G. Ammerer, Methods in Enzymology, 101, 192-201 20 (1983)]. Az Xhol hely mellett egy PstI és egy Hindin hely található, így a paF-ből származó a-faktor gén 250 bp hosszú HindlII/PstI fragmentumát, amely az a-faktor vezérszekvencia nagy részét magába foglalja (7. ábra), a pES 103-ban lévő HindlII és PstI hely közé 25 beépíthetjük ligáz segítségével. Az a- faktor vezérszekvenciával rendelkező HindlII/PstI fragmentum DNS szekvenciáját leközölték [A. Singh és munkatársai, Nucleic Acids Res., 11, 4049-4063 (1983)]. A pES103 1 pg-ját és a pccF 5 pg-ját 50 mM 30 trisz.HCl-t (pH-8,0), 10 mM MgCl2- t és 50 mM NaCl-t tartalmazó oldatban HindÜI-mal és Pstl-gyel teljesen megemésztjük és mint fent leírtuk (7. példa), ligázzal összekapcsolunk mintegy 50 ng pES103 (HindlII/Pstl) és mintegy 500 ng paF (HindlII/PstI) termé- 35 két. A kapott plazmiddal E.coli HB101 sejteket transzformálunk. Azt a plazmidot, amely az a-faktor vezérszekvenciát az ADHI promoterhez viszonyítva a megfelelő orientációban tartalmazza, pWS205D-nek neveztük el. Az ADHI promoterrel való kapcsolat he- 40 lyén az a-faktor vezérszekvenciából hiányzó 25 bp-t az ATG start kodonnal együtt egy foszfotriészter módszerrel [V.A. Efimov és munkatársai, Nucleic Acids Res., 10, 6675-6694 (1982)] szintetizált 40mer oligonukleotiddal helyettesítettük. Erre a célra 1 pg 45 pWS205D-t Xhol-gyel és Pstl-gyel 36 “C-on, 50 mmól trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCl2 és 50 mM NaCl tartalmú oldatban teljesen megemésztünk. Az Xhol és PstI végekkel rendelkező oligonukleotidot 5’ TCGAGAAAAGAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA 3’ 3’ CTTTTCTTACrCTAAAGGAAGTTAAAAATG 5’ Xhol PstI az XhoI/Pstl-gyel hasított pWS205D plazmidba építjük be úgy, hogy az oligonukleotidot 10 pmól/pl koncentrációban vízben vesszük fel, a két DNS szál 5-5 pl-es oldatait egyesítjük, 10 percig 65 “C-on melegítjük és szobahőmérsékletre való lehűtés után ennek az oldatnak 1 pl-jét használjuk fel a ligáz reakcióhoz. A reagáltatást ligáz pufferben végezzük a 7. példában leírt feltételek mellett. Az így keletkezett pWS209D plazmid most már tartalmazza a körülbelül 1,5 kb hosszú szakaszt az ADHI promoterrel és a komplett a-faktor vezérszekvenciával együtt, az a-faktor kódoló szakaszának kezdetéig. 55 60 12
