202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 A találmány tárgya eljárás humán lizozim proteint meghatározó cDNS szintézisére és izolálására, valamint a humán lizozim előállítására. Részletezve, a találmány egy olyan bakteriális plazmidra vonatkozik, amely a humán lizozim szignál-peptidjének egy részét meghatározó cDNS szekvenciát, a teljes érett humán lizozim proteint meghatározó cDNS szekvenciát és 3’ végén a humán lizozim gén egy nem-kódoló szekvenciájának egy részét tartalmazza. A találmány tárgyát képezik ezenkívül kifejező vektorok is, ilyenek a humán lizozimet kódoló nukleotid szekvenciát inszertumként tartalmazó plazmidok és különböző olyan gazdaszervezetek és tenyészetek, amelyek a humán lizozim előállítását lehetővé teszik. A lizozimek 1,4-ß-N-acetil-muramidäzok, amelyek a baktériumok peptidoglükánjában az N-acetil-muraminsav (MurNAc) C- 1 szénatomja és az N-acetil-glükózamin C-4 szénatomja közötti glükozidos kötést hasítják [D.C. Phillips, Sei. Am., 215, 78-90 (1966)]. Alexander Fleming fedezte fel 1922-ben, hogy különböző szövetek és szekrétumok, valamint a tyúktojásfehérje, bizonyos Gram-pozitív baktériumokat lizálni képesek. Ezt a lizáló faktort ő lizozimnek nevezte el, minthogy ez egy olyan enzim, amely baktériumok feloldására (lizálására) képes. Fleming kimutatta, hogy a lizozim előfordul porc- és gyomor-szövet homogenizátumokban, könnyben, nyálban, köpetben, orrváladékban, patológiás vizeletben, szérumban és a leukocitákban, de nem található meg egészséges emberek vizeletében, a cerebrospinális folyadékban vagy az izzadságban [A. Fleming, Proc. Roy, Soc., Ser 893, 306- 307 (1922)]. Úgy tűnik, hogy a lizozimnek, mint antibakteriális szemek a hatása közvetlen bakteriolitikus hatása révén, vagy a makrofágok fagocitózisával összefüggésben, stimuláló tulajdonsága révén nyilvánul meg [W.D. Biggar és J. M. Sturgess, Infect. Immunoi., 16, 974-982 (1977); M. Thacore és H.P. Willet, Am. Rev. Resp. Dis., 93, 786-790 (1966)]. Ki lehetett mutatni, hogy a lizozimnek jelentős szerepe van mint közvetítőnek a patkányok alveoláris makrofágjai által kifejtett, a mikroorganizmusokkal szembeni védekezésben: intakt baktériumoknál nem történt fagocitózis, míg a lizozim által károsított kabtériumok gyorsan fagocitálódtak [W.D. Biggar és J.M. Sturgess, Infect. Immunoi., 16, 974-982 (1977)]. Ugyancsak kimutatták, hogy a lizozim közvetlenül meg tudja növelni a polimorfonukleáris leukociták [M.I. Klockars és P. Roberts, Acta Haematol., 55,289- 292 (1976)] és a makrofágok [M. Thacore és H.P. Willet, Am._ Rév. Resp. Dis., 93, 786-790 (1966)] fagocitáló aktivitását. A lizozim hatásmechanizmusának a vizsgálatát, azaz hogy hogyan hat a száj mikroorganizmusaira, a következő törzsekkel végezték el: a Streptococcus mutans hét szerotípusával, a Veillonella ascalescens-sel és az Actinomyces viscosus T14 virulens és avirulens törzseivel. Az eredmények azt mutatták, hogy a bakteriosztatikus, litikus és baktericid tulajdonságokért különböző mechanizmusok lehetnek felelősek, s hogy az enzim nemcsak szelektív, hanem hatékony faktor is a száj mikroorganizmusai elleni küzdelemben [V.J. Iacono, B.J. Mackay, S. DiRienzo és J.J. Pollok, Infect. Immunoi., 29, 623-632 (1980)]. A lizozim egyéb feltételezett funkciói közé tartozik az immunstimuláció [P. Jolles, Biomedicine, 25, 275-276 (1976)] és a gazdamembránok immunológiai és nem immunológiai ellenőrzése neoplazmás transzformáció vonatkozásában [E.F. Ossermann, Adv. Pathobiol., 4,98-102 (1976)]. A lizozim meghatározását szérumból és vizeletből, különböző betegségek diagnosztizálására használják fel vagy mint e betegségek indikátora gyanánt. Az akut limfoblasztoid leukémiánál a szérum lizozim szintje jelentősen csökkent, míg krónikus mieloid leukémiánál és akut monoblasztoid és mielomonocitóziso leukémiánál a lizozim koncentrációja a szérumban erősen emelkedett [P. Jolles, M. Sternberg, G. Mathe, Isr. J. Med. Sei., I, 445-447 (1965); E.F. Ossermann és D.P. Lawlor, J. Exp. Med., 124, 921-952 (1966)]. A lizozim hatásos terápiás alkalmazása a különböző bakteriális- és vírusos-fertőzések (Zona, Herpes zoster) esetén képzelhető el, továbbá colitisnél, különböző fájdalmak esetén, allergiáknál, gyulladásoknál, továbbá a gyermekgyógyászatban (a tehéntej matemizálása lizozim hozzáadásával). A lizozim más biológiailag aktív proteinekkel úgy reagál, hogy azok teljesen kibontakoztathassák hatásukat (Adinolfi közleménye Lampert és Woods kiadványában, Academic Press, London, 1981, 19-47. oldal). Ilyen proteinek például a komplement fehérjék, a laktotranszferrin, amely bizonyos mikroorganizmusok szaporodását vas-kelát-komplex képződés révén gátolja és az antitestek, mint a tejben lévő szérum IgA, amely a laktotranszferrin antibakteriális hatását fokozza [Spik és munkatársai: Bull. Eur. Physiopath. Resp., 19, 123-130 (1983)]. A lizozimet, Iaktotranszferrínt és az immunglobulinokat együttesen is meg lehet találni a különböző természetes szekretumokban, mint a nyálban, könnyben, a különböző tej-féleségekben [Jorieux és munkatársai, Protides of the Biological Fluids, 31. kollokvium (1984)], a hörgő- nyálkahártyában, valamint a tojásfehérjében. Ami a lizozim további felhasználását illeti, előnyösen alkalmazható reumás láz és reumás fájdalmak csillapítására és terápiás hatást fejt ki a reumatoid-artritiszes tünetkor betegségeinél („Fleming-féle lizozim”; 3. nemzetközi szimpózium, 1964, Milánó). Később a lizozimnek analgetikus tulajdonságokat is tulajdonítottak [Bianchi, Eur. J. Phanmacol., 71, 211-221 (1981)]. Újabban antinociceptív hatást is ki tudtak mutatni a lizozimnél [Bianchi, Clin. Exp. Phamacol. Physiol., 10, 45-52 (1983)]. A lizozim hatásmódjának széles palettája arra enged következtetni, hogy megfelelően széles spektrumú a terápiás alkalmazhatósága és így jelentős gazdasági értéket képvisel. A lizozim fent felsorolt gyógyászati alkalmazásainál a humán lizozimet (HLZ) kell előnybe helyezni a tojásfehérjéből előállított lizozimmel szemben, mivel a fajidegen lizozimek felhasználásakor anafilaxiás és/vagy allergiás természetű mellékhatások várhatók, s ezek a gyógyítás útjába állhatnak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
