202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 A humán lizozim előállításának mindmáig egyetlen kereskedelmi fonása az emberi tej és emberi placenta volt. Ezeket a kiindulási anyagokat azonban csak nagyon korlátozottan lehetett beszerezni és nyilvánvaló, hogy belőlük gyártási tételenként különböző készítmények nyerhetők. A nagyon fejlett ipari mikorbiológia és a legújabban kifejlesztett rekombináns DNS technológia hasznosításának az előnyei a humán lizozimnek mikroorganizmusokban való termelésénél is megmutatkoznak. A tojásfehérje lizozimet meghatározó gént izolálták [A.E. Sippel, H. Land, W. Lindenmair, M.C. Nguyen- Hum, T. Wurtz, K.N. Timmis, K. Giesecke és G. Schütz, Buci. Acid. Res., 5, 3275-3294 (1978); P. Baldacci, A. Royal, B. Cami, R. Perrin, A. Krust, A. Garapin és P. Kourilsky, Nucl. Acid Res., 6, 2667-2681 (1979)] és a tojásfehérje lizozim mRNS, valamint a génen lévő exon - ennek határszakaszait is beleértve- nukleotid szekvenciáját is meghatározták [A. Jung. A.E. Sippel, M. Grenz és G. Schütz, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5759-5763 (1980)]. Megállapították továbbá a T4 bakteriofágból származó lizozim gén nukleotid szekvenciáját [J.E. Owen, D.W. Schultz, A. Taylor és G.F. Smith, J. Mól. Bioi., 165,229-248 (1983)]. Ismert volt a HLZ aminosav szekvenciája [J. Jolles és P. Jolles, Helv. Chim. Acta, 54, 2668-2675 (1971); R. E. Canfield, S. Kammermann, J.H. Sobel és F.J. Morgan, Nature New Bioi., 232, 16-17 (1971); P. Jolles és J. Jolles, Molec. and Cellul. Biochem., 63, 165— 189 (1984)], de nem volt ismeretes a találmány szerinti HLZ-t kódoló nukleotid szekvencia. Muraki, M. és munkatársai az Agric. Bioi. Chem., 49(9), 2829-31 (1985) közleményben leírják humán lizozim E. cliban (E. coli SK 107) egy szintetikusan előállított nukleotidszekvencia alkalmazásával végzett kifejezését. Az expresszió azonban mégsem eredményez használható anyagot, mert oldhatatlan és inaktív termék keletkezik, amely a gazdasejten belül halmozódik fel. Javasolják ugyan a probléma megoldására, hogy a HLZ-t valamilyen eljárással oldatba kellene vinni, és ezzel regenerálni biológiai aktivitását, de ilyen regenerálási eljárást nem közölnek. Az EPA 181 634 számú európai szabadalmi bejelentés leírja a humán lizozimnek az élesztőben és a Bacillus subtilisben való kifejeződését. Attől eltekintve, hogy az EPA 181 634 számú európai szabadalmi bejelentés szerint nem alkalmaznak speciális élesztőterminátort és autentikus HLZ gént, ezen HLZ-DNS szekvenciához - élesztőben való kifejeződés esetében- nem kapcsolódik vezérpeptidet kódoló DNS szekvencia. így a képződött HLZ-t nem lehet a gazdasejtből kivonni, s ezáltal megnehezedik a pontos tercier szerkezetnek a kialakítása diszulfid hidak képzésével. Tehát nem lehet megtudni a szóban forgó 181 634 számú bejelentésből, hogy hogyan juthatunk az autentikus HLZ-hez. Szintén nem tudjuk meg belőle, hogy hogyan távolítják el a start metionint. A feladat, amely a jelen találmány alapját képezi, abban áll, hogy egy olyan stratégiát dolgozzon ki, amelynek segítségével a HLZ aminosav szekvenciájáról meglévő minimális információ alapján cDNS-t lehessen szintetizálni, majd klónozni és hogy ez egy biológiailag aktív HLZ protein kifejezésében nyilvánuljon meg. A problémát úgy oldjuk meg, hogy egy mRNS templát segítségével olyan bakteriális hibrid-plazmidokat szerkesztünk, amelyek HLZ-t meghatározó cDNS-t tartalmaznak. A HLZ-DNS, amely a bakteriális hibrid vektor részét képezik, valamilyen emberi HLZ-termelő sejtből származhat. Alkalmas sejtek például a placenta sejtek, az akut monoblasztoid és/vagy mielomonocitózisos leukémiában szenvedő emberek leukocitái, az emberi vastagbél ráksejtjei, az U-937 sejtvonal vagy más, HLZ-t termelő sejtvonalak. A jelen találmány előnybe helyezi az ember U-937 sejteket (ATCC CRL 1593) és ezt használja. A HLZDNS-t HLZ gént tartalmazó génbankból izolálhatjuk. Ebben a találmányban nem használunk kromoszómális DNS-t, mivel ez a kódoló szakaszán belül valószínűleg intronokat tartalmaz [például a tyúktojás-fehérje lizozim génje három intront tartalmaz; A Jung, A. E. Sippel, M. Grez és G. Schütz, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5759-5763 (1980)], amelyeket élesztő segítségével nem lehet kihasítani. A jelen találmány a humán cDNS-t helyezi előnybe. Az U-937 sejtekből izolált mRNS előnyös templátot jelent a humán lizozim cDNS szintézise számára. A HLZ-cDNS első szála szintézisének reakcióját oligo (dT)i8 primerrel indítjuk meg, amely előnyös módon a szóban forgó mRNS 3’ végével tud párt képezni-. Dezoxiribonukleozid-trifoszfátok (dNTP-k) és reverz transzkriptáz jelenlétében történik a cDNS szimpla szálának a meghosszabbítása. Az egyszálú cDNS-t ezután különböző ismert módszerekkel lehet kettős szálú cDNS-sé konvertálni. Ebben a találmányban a Gubler és Hoffmann féle módszer [U. Gubler és B.J. Hoffmann, Gene, 25, 263-269 (1983)] használatát tartjuk előnyösnek. Az egyszálú cDNS-ből úgy történik a kétszálú cDNS szintetizálása, hogy a mRNS hibridet RNázH-val és DNS-polimeráz I-vel kezeljük dNTP-k jelenlétében. Ezzel a módszerrel olyan kétszálú cDNS- t kapunk, amelyet közvetlenül klónozhatunk. A kétszálú cDNS-nek baktérium-vektorokban való klónozását különböző ismert módszerekkel lehet elvégezni. A kétszálú cDNS-t, mint tompa végű fragmentumot közvetlenül, szintetikus linker közvetítésével vagy a „homopolimer-tailing” néven ismert módszerrel lehetklónozni. A HLZ-cDNS klónozása esetében a homopolimer-tailing módszert helyezzük előnybe. Ennél a módszernél a HLZ-DNS 3’ végén lévő tompa (blunt), illetve lépcsős (staggered) végekre terminális transzferáz segítségével és nukleotidok (előnyösen dGTP) hozzáadásával, szimpla szálakat építünk. Egy másik reakcióban a baktérium plazmidot valamilyen restrikciós endonukleázzal linearizáljuk (a HLZ-cDNS klónozása esetén a pUC9 vektort helyezzük előnybe) és komplementer farkakkal (előnyösen dCTP-vel) látjuk el, hogy 3’ végükön komplementer szimpla szálakat kapjunk. A következő lépésben a homopolimer módszerrel meghosszabbított kétszálú cDNS-t a megfelelő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
