202922. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új limfotoxin-polipeptidek előállítására
1 HU 202 922 B 2 A találmány tárgya eljárás limfotoxin-aktivitással vagy limfotoxin-szerű aktivitással rendelkező új polipeptidek előállítására. A limfotoxint (amelyet béta-TNF-nek is neveznek) 1968-ban írták le először [Ruddle and Waksman, J. exp. Med. 128, 1267-1279 (1968); Gramger und Kolb, J. Immun. 101, 111-120 (1968); Rosenau, W. Fed. Proc. 27, 34-38 (1968)]. A limfotoxin, mint mitogén stimulált limfocitákból származó biológiai faktor daganatos (neoplazmás) sejtvonalakra citotoxikus hatású. Hatásspektruma kiterjed például néhány tumor-sejtvonal osztódásának gátlására (Cytostase), és jelentős citolitikus hatása van más transzformált sejtekre [Sawada and Osawa; Jap. J. Exp. Med. 46, 263-267 (1976); Granger et al., J. Cell. Immun. 38, 488-402 (1978); Rundell and Evans, Immunpharmacology 3, 9-18 (1981); Granger et al., J. Lymphokine Res. 1, 45-49 (1982); Ruddle et al., J. Lymphokine Rés. 2, 23-31 (1983)]. Primer sejttenyészetekre és normális sejtvonalakra a limfotoxin citotoxikus hatása gyengébb vagy nincs ilyen hatása. Ezek az észleletek in vivo vizsgálatokhoz vezettek [Khan et al., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 169, 291-294 (1982); Papermaster et al., Cancer 45, 1248- 1253 (1980); Ransom et al., J. Natn. Cancer Inst. 69, 741-744 (1982)], amelyek eredményei azután azt mutatták, hogy a limfotoxin hatásos daganatellenes szer. A humán limfotoxin aminosavszekvenciáját [Gray et al., Nature 312, 721-724 (1984)] az 1. ábrán láthatjuk. A limfotoxin szignálszekvenciáiát -34-től -1-ig terjedő számozással jelöljük. A humán limfotoxin (béta-TNF) a limfotoxinok egyik olyan csoportjához tartozik, amelyhez a tumor nekrózis faktor (TNF vagy alfa-TNF) is tartozik. A két proteinnek nemcsak hasonló in vitro és in vivo hatásspektruma van, hanem gammainterferonnal is szinergikusan hatnak [Ruddle et al., Lymphokine Rés. 2, 23- 31 (1983); Granger et al., Lymphokine Res. 1, 45-49 (1982); Ruff and Giffort, Lymphokines Vol. 2, Pick. E. ed. 235-275, Acadenic Press New York (1981); Carswell et al., Pross. Natl. Acad. Sei. 72, 3666-3670 (1975); Evans, Canc. Immunoi. Immunothre. 12, 181- 190 (1982); Rundell and Evans, Immunopharmacology 3, 9-18 (1981); Ruff and Giffort, Infect. Immun. 31, 380-385 (1981); Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 80, 5397-5401 (1983); Williams and Bellanti, J. Immunoi, 130, 518-520 (1983); Stone-Wolff et al., J. Exp. Med. 159, 828-843 (1984); Lee et al., J. Immunoi. 133, 1083-1086 (1984); Powell et al„ Lymphokine Rés. 4, 13-26 (1985)]. A két protein génjei a 6-os kromoszómán egymás szomszédságában helyezkednek el [Nedwin et al., Nucl. Acid. Rés. 13, 17; 6361-6373 (1985)]. A két protein aminosavainak összehasonlítása azt mutatja, hogy az aminosavegységekre nézve 30% homológia áll fenn (2. ábra). A homológia a két protein középső és C-terminális részére összpontosul, míg az N-terminális rész heterológ és eltérő hosszúságú (2. ábra). Ismeretes továbbá egy olyan limfotoxin-mutáns, amely N- terminális részén a természetes limfotoxintól abban tér el, hogy az első 23 aminosav hiányzik belőle. Felfedeztük, hogy azok a polipeptidek, amelyek a limfotoxin 25-171 és 26-171 aminosavszekvenciájából állnak, és az N-terminális végen még egy metionilvagy alanil-csoportot tartalmaznak, előnyösebb tulajdonságokkal rendelkeznek. Új peptidek úgy állíthatók elő, hogy a) elkülönítjük az mRNS-t egy limfotoxint termelő sejtvonalból, b) ezt az mRNS-t átmásoljuk a megfelelő kétszálas cDNS-sé, c) ezt a cDNS-t inszertáljuk E.coli vektorokba, d) az így kapott új vektorokkal E.colit transzformálunk, e) a limfotoxin cDNS kiónokat génszondák és hibridizálás segítségével szelektáljuk és jellemezzük, f) a limfotoxin gént tartalmazó vektorokat szaporítjuk, és elkülönítjük, g) a gént vagy a génfragmenseket restrikciós endonukleázok segítségével elkülönítjük, h) a megfelelő oligonukleotidokat tartalmazó gént vagy génfragmenseket expressziós vektorokba inszertáljuk, i) adott esetben a gént 5’-végéhez kiegészítő DNS- szekvenciákat inszertálunk, j) az ilyen expressziós vektorokkal E. colit transzformálunk, és k) a kívánt génterméket kifejezzük, elkülönítjük, és megtisztítjuk. A megfelelő cDNS elkülönítése céljából az RPMI 1788 limfoblasztoid-sejtvonalat (ATCC Nr. CCL 156) a leírtak szerint [Aggarwal et al., J. Bioi. Chem. 259, 686-691 (1984)] tenyésztjük, stimulálás után elkülönítjük az mRNS-t, és ismert eljárások szerint cDNS-re lefordítjuk. A cDNS-klón a 3. ábrán megadott szekvenciájú. Ennek a szekveciának azokat a részeit használjuk a példákban közelebbről leírt új limfotoxinszerú polipeptidek klónozásához, amelyek restrikciós felismerési helyeken végzett enzimes hasítással könnyen hozzáférhetők. A génffagmensek klónozó vektorokba, például a hozzáférhető pUC18 és pUC19 plazmidokba [Gene, 19, 259 (1982) és 33, 103 (1985)] való beépítése a szakirodalomban leírt módszerekkel (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) történik. A gének vagy génffagmensek alkalmas, kémiailag szintetizálható olyan kontrollszakaszokkal is elláthatók, amelyek lehetővé teszik a proteinek kifejezését. Az így kapott hibridplazmidok alkalmas gazdaszervezetekben, például E. coli-ba való transzformációja szintén ismert és behatóan leírt [Maniatis etal; loc. cit. 250. és 251. old.]. A hibridplazmidok megfelelő szignálszekvenciákkal is elláthatók, amelyek a polipeptideknek E. coli periplazmájában való kiválasztását lehetővé teszik. Ezek az így nyert proteinek azután N-terminális végükön a kiválasztás után metionint nem tartalmaznak, viszont van legtöbbször még egy, a hasítási hely szempontjából fontos amino-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
