202922. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új limfotoxin-polipeptidek előállítására
1 HU 202 922 B 2 savuk, például alanin [Nucl. Acid. Res. 8, 3011-3027 (1980)]. A genetikai kód degenerációja alapján az is lehetséges, hogy az új polipeptidek kifejezésére más DNS- szekvenciákat, például eltérő DNS-szekvenciájú kémiailag szintetizált géneket használjunk. Az új peptidek a daganatos megbetegedéseknél, immunbetegségeknél vagy gyulladásos megbetegedéseknél, például reumánál vagy poliartritisnél használhatók. Az új pepetidek hatása limfokinek, például alfa- TNF és különösen alfa-interferon, béta-interferon és gamma-interferon, valamint kancerosztatikumok hozzáadásával hiperadditív módon fokozhatók. Kancerosztatikumokként különösen a következők jönnek számításba: a) antibiotikumok, például aktinomicin-D, doxorubicin (adriamicin), daunorubicin, mitramicin és bleomicin, valamint más interchalatorikus - azaz a kétszálú DNS-be vagy RNS-be két szomszédos dózispár közé beépülő - hatású anyagok, például amonafíd és mitonafíd, b) alkaloidok, például vinkrisztin, vinblasztin, vindezin, etopozid és tenipozid, c) alkilező hatású anyagok, például ciklofoszfamid, nitrozó- karbamid és ciszplatin, és d) antimetabolitok, például metotrexat, 5-fluor-uracil és analógjai, 6-merkapto-purin, 6-tioguanin és citarabin. A találmány tárgyát képezik ezért az új peptidek limfokinokkal, például alfa-TNF-fel és különösen gammainterferonnal készített kombinációi. A találmány tárgyát képezik olyan gyógyszerkészítmények is, amelyek legalább egy új polipeptidet tartalmaznak, adott esetben valamilyen gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval vagy kötőanyaggal kombinálva. Továbbá szintén a találmány tárgyát képezik az új proteinek már ismert limfokinokkal vagy limfokin-mutánsokkal (például gamma- interferonnal, TNF-fel) készített kombinációit tartalmazó gyógyszerkészítmények. A találmány további megvalósításait a következő példákban részletesen leírjuk. Az összehasonlítási anyagként használt limfotoxint a limfotoxin-mutánsokhoz hasonló módon E. coli-ban klónozzuk, kifejezzük és a leírtak szerint tisztítjuk. Példák 1. A cDNS előállítása. A limfotoxint (béta-TNF) termelő RPMI-1788 sejtvonal tenyésztése. Az ATCC-től kapott (No. CCL 156) RPMI-1788 haematopoietikus sejtvonalat Spinner palackban 20% borjú magzatszérumot tartalmazó RPMI1640 táptalajban (Sigma Chemie. GmbH, Deisenhofen, NSZK, R7880) 37 °C-on és 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában tenyésztjük. A táptalajt 7-8* 105 sejt/ml sejtsúníség elérése után 5% borjú magzatszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajra cseréljük, és az előzetesen meghatározott 150 nmól optimális koncentrációnak megfelelő PMA (4ß-forbol- 12ß-mirisztit-13aacetát) (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, NSZK, P8139sz.) tumorpromotort adunk hozzá. Maximális mennyiségű limfotoxin (700 egység/ml) 70 óra elteltével termelődik. A biológiai aktivitást az irodalomban leírtak [Aggarwal, B.B.; Moffat B. and Harkins, R.N.; J. Bioi. Chem. 259, 686-691,(1984)] szerint határozzuk meg. A fenti idő elteltével a sejteket összegyűjtjük, 2 ml PBS-sel (foszfátpuffer oldat) mossuk, és lizáló pufferban [6 mól guanidinium-fofanid, 5 mmól 7,0 pH-jú nátrium-citrát, 0,1 mól 2-merkapto-etanol, 0,5% szarkozil (N- lauril-szaikozin)] homogenizátor segítségével feltárjuk. Az RNS-t 5,7 mólos cézium-klorid „párnán” percenkénti 35000 fordulatnál éjszakán keresztül ülepítjük. A mRNS poliA+ tartalmú frakcióját oligo(dT)-cellulózon kétszeres affinitáskromatográfiával izoláljuk és tisztítjuk. A poliA+ mRNS-t az AMV reverz transzkriptáz enzimmel egyszálas cDNS-be írjuk át. A másik szál szintézise szintén reverz transzkriptázzal történik. A kétszálas cDNS-t Sau 3A restrikciós endonukleázzal a gyártó (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, NSZK) adatai szerint hasítjuk és 1%-os agarózgélen frakcionáljuk. Az 1 kbp *0,5 kbp nagyságú DNS-fragmenseket kioldjuk a gélből és defoszforilált BamHI-linearizált E. coli pUC18 vektorral (Boehringer Mannheim, NSZK) Egáljuk. A DNS-t kompetens E. coli HB101 törzs sejtjeibe transzformáljuk (Maniads et al., loc. cit. 250. és 251. old.) és 100'5 g/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezeken szélesztjük. A baktériumokat nitro-cellulóz szűrőre visszük át, replikáljuk, lizáljuk, a DNS-t denaturáljuk, és szilárdan a szűrőre kötjük. DNS-szintetizátor (Applied Biosystem, Typ 380A) segítségével a humán-limfotoxin közzétett DNS-szekvenciájához homológiával rendelkező három heptadekamer oligonukleotid szondát állítunk elő. Ezen szondák szekvenciája a következő: 5’ CCTCCTGCACCTGCTGC 3’ 5’ TTGCTGGGGTCTCCAAT 3’ 5’ GAGTGCAGCCAGGGTTC 3 Az oligonukleotid szondákat 5’-végen y-32P-ATP- vel jelezzük, és a nitro-cellulóz szűrőt 1 mólos nátrium-klorid, 1 mmólos EDTA, 1%-os SDS (nátrium-dodecil-szulfát), 10%-os dextrán-szulfát oldatban 42 ’C- on éjszakán keresztül rázatjuk a szondákkal. A szűrőt intenzíven mossuk 1 mólos nátrium-klorid, 1 mmólos EDTA, 1%-os SDS oldattal, utána a szűrőt filmre exponáljuk, és megállapítjuk a szekvencia homológiával rendelkező kiónokat. A homológ kiónokat elkülönítjük, és szétválasztjuk. A plazmid DNS-t elkülönítjük, és szekvenáljuk. Egy ilyen elkülönített klón a pLyt 15, amelynek szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be. 2. Olyan hibridplazmid előállítása, amely tartalmazza a 24-171 aminosavszekvenciával rendelkező öszszehasonlító anyag (delta 23 limfotoxin) részére a génfragmenst. Kiindulási pont a pLyt 15 plazmid. Ez az Sau 3-val hasított limfotoxin cDNS-nek (lásd 3. ábra) a pUC18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
