202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

1

HU 202 921 B

2

CGGGCCAATGCCCTl CGT jC34ACGCCCT

36C

CTGGCCA AplGGClGfrG CTGGCCAAp|GGC(ArG 3W

GAGCT

AAGCT

g[a|ga|ga|iiaaccagctggtggtgcc|a

c|apg|ga|caaccagctggtggtgccg

~?20

C AGA

GjC

GT

GT

GA

GGGCCTGTACCTC ATCTACTCCCAG GGGCTGTACCTCATCTACTCCCAG

CCTCTTCAAG

T5"ö"

GG

CCAAGGCTGCC

CTCTTCAGCGGrCAAGGCTGCCG

CCTCC

CTCC

ACCC|Ätr|GTGCTCCTCAC|C|CAC AdC A

480- -TA

GTGCTCCTCACTCACAC

TG

TCAGC TCAGC TTTT

CGCATCGCCGTCTCCTACCA CGCTTCGCCGTCTCCTACCC

GA CCAAGGTC

GA

ACAAGGTC

540

AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC

570

CAGA

GGGAGACCCCA

GAGGGGGCTGAG

CACCGGGAGACCCCC GAGGAGGCTGAG C

GCC

CC

AT 3 3

CCCTGGTATGAGCCCATCTAT

CCTGGTAPlG AGCCCATCTAlCjCTGGG

FÉ

CTGGG

600 A

GTCTTCCAG

TGGAGAAGGGTGACCG

GTCTTCCAG TTGGAGAAGGGTGACCG

C

0

1A

660

CTCAGC

CTCAGCA

GAGATCAAT

C GAGGTCAAC C

CG3CC

GACTAT

AGCCTGAGTAC

690

CTC

CT

GAC

GGAC

TTGCCGAGTCT

CTTGCCGAGTC

GGGCAGGTCTAC

CGGGCAGGTCTAC

TTTGGGATCATTGCCCTGTGA TTTGGGATCATTGCCCTGTGA

A bekeretezett részek homológ szakaszokat jelentenek-----jelentése: egy kodon hiányzik

*** jelentése: terminációs kodon

[1-3] A találmány értelmében a DNS-eket az alábbi eljárások szerint állíthatjuk eló.

A humán TNF polipeptidet, vagy annak fő részét kódoló DNS-t úgy állítjuk elő, hogy humán makrofágokat indukálószer(ek)kel együtt tenyésztünk, a humán TNF mRNS-t tartalmazó frakciót elválasztjuk az indukált sejtekből, a frakcióból egy cDNS-t állítunk elő, és a humán TNF cDNS-t differenciál hibridizációs módszerrel klónozzuk, mintaként megfelelő DNS-t - például nyúl TNF cDNS-fragmenst - használva, vagy differenciál hibridizációs módszert használunk, mRNS hibridizáció-transzlációs vizsgálattal kiegészítve.

A DNS-t tehát az alábbi lépésekkel állíthatjuk elő:

A) humán makrofágokat indukálószer(ek)kel együtt tenyésztünk,

B) a humán TNF mRNS-t tartalmazó frakciót elválasztjuk az indukált sejtekből,

C) a mRNS-ből reverz transzkriptázzal sscDNS-t állítunk elő, majd azt dscDNS-sé alakítjuk,

D) a dscDNS-t egy vektorba illesztjük,

E) a rekombináns vektort egy gazdaszervezetbe juttatva a gazdaszervezetet oly módon transzformáljuk, hogy az egy cDNS génállományt képezzen,

F) kiválasztjuk a hTNF-et kódoló kiónokat, és

G) a humán TNF polipeptidet vagy annak fő részét kódoló cDNS-t a fenti génállományból klónozzuk.

A DNS előállítását részletesen az alábbiakban ismertetjük, a korlátozás szándéka nélkül.

45

50

55

60

10