202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 (1) Humán TNF mRNS előállítása A humán TNF mRNS-t humán makrofágokból állíthatjuk elő, például az alábbiak szerint. A humán makrofágokat például humán alveoluszból nyerhetjük, Sone és munkatársai [J. Immunoi. 129, 1313 (1982)] módszerével, vagy vérből, Matthews [Br. J. Cancer, 48, 405 (1983)] módszere, szerint vagy placentából, Wilson és munkatársai [J. Immunological Methods, 56, 305 (1983)] módszerével, vagy egyéb szövetekből. A kapott makrofágokat egy csészébe oltjuk le, 2*104-M06 sejt/cm2 sejtsűrűséget biztosítva, majd 35-38 °C-on, előnyösen 37 °C körüli hőmérsékleten 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben 30 perc - 2 órán át előtenyésztjük. Ezután indukálószerként egy Gram-negatív baktériumból kapott endotoxint - előnyösen Escherichia coli-ból, Pseudomonas aeruginosa-ból vagy Salmonella typhi-ből származó lipopoliszacharidot -, és proteinszintézis-inhibitorként cikloheximidet adunk a sejtekhez. A tenyésztést 3-8 órán át tovább folytatjuk, hogy a makrofágokban felhalmozódjon a humán TNF mRNS. Az előtenyésztést el is hagyhatjuk. Az endotoxin mennyisége általában 0,1-1000 mikrogramm/ml, előnyösen 1-100 mikrogramm/ml. Ekkor indukálószerként egy fórból-észtert - például fórból-12-mirisztát- 13-acetátot, forbol-12,13-didekanoátot vagy forbol- 12,13-dibenzoátot - is adhatunk a rendszerhez 1-2000 ng/ml koncentrációban. A proteinszintézis-inhibitor mennyisége annak típusától függően változik. Cikloheximidből például 0,1-50 mikrogramm/ml mennyiséget használunk. Tápközegként emlős sejtek tenyésztésére alkalmas különféle táptalajokat használhatunk, például RPMI-1640 táptalajt, Eagleféle minimáltáptalajt (MÉM), vagy Dulbecco-féle módosított minimáltáptalajt [a fenti táptalajok összetételét például a „Cell Cultivation Manual”, szerkesztő Y. Sohmura, Kodansha (1982), vagy J. Paul: ’’Cell and Tissue Culture”. E. and A. Livingstone Ltd. (1970) irodalmi helyeken találhatjuk meg], A tápközeghez előnyösen állati szérumot - például magzati marhaszérumot vagy borjúszérumot - is adunk, 1-20% mennyiségben. A tenyésztési szakasz befejeztével, az RNS-t a szokásos módszerekkel - például Chirgwin és munkatársai [Biochemistry, 18, 5294 (1979)] módszerével - extraháljuk a sejtekből, majd oligo(dT9-cellulózon vagy poli(U)-Sepharose-on affinitási oszlopkromatográfiás eljárással, vagy szakaszos módszerrel elválasztjuk a poli(A)mRNS-t tartalmazó frakciót. A poli(A)mRNS-t tartalmazó frakciót sav-kaibamid agaróz gélelektroforézisnek, vagy szacharóz sűrűséggrasdiens centrifugálásnak alávetve humán TNF mRNS-ben feldúsult mRNS-frakciót nyerhetünk. Annak megerősítésére, hogy a kapott mRNS-ffakció valóban a humán TNF polipeptidet kódoló mRNS-t tartalmazza, a mRNS-sel fehérjét szintetizáltunk, és a kapott fehérje biológiai aktivitását megvizsgáltuk. Ezt a vizsgálatot például úgy végezhetjük el, hogy a mRNS-t Xenopus laevis oocitájába injektáljuk, vagy megfelelő protein-szintetizáló rendszerhez - például retikulocita-lizátumhoz vagy búzacsíra sejtmentes protein-szintetizáló rendszerhez - adjuk, és kimutatjuk, hogy a transzláció révén keletkezett protein egér L- sejtekkel szemben in vitro citotoxikus hatást fejt ki. (2) Humán TNF cDNS klónozása A fenti (1) lépés szerint kapott poli(A)mRNS-frakciót vagy a feldúsított mRNS-frakciót használjuk templátként, és printerként egy oligo(dT)-t használunk sscDNS előállítására, reverz transzkriptáz - például madár mieloblasztozis vírusból származó reverz transzkriptáz (AMV) - segítségével, dATP, dGTP, dCTP és dTTP jelenlétében. Ezután az sscDNS-t templátként használva dscDNS-t szintetizálunk, reverz transzkriptáz vagy E. coli DNS-polimeráz I (nagy fragmens) segítségével. A kapott dscDNS-t például a pBR322 plazmidba illesztjük, a restrikciós endonukleáz Pst 1 hasítási helyén, a szokásos módon, például poli(dG)-poli(dC) homopolimer extenziós módszerrel [T.S. Nelson: Methods in Enzymology, 68, 41 (1979), Academic Press Inc., New York]. A kapott rekombináns plazmidokat ezután egy gazdasejtbe - például E. coli 1776-ba - juttatjuk Cohen és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 69, 2110 (1972)] módszere szerint, transzformálás céljából, majd a tetraciklin- rezisztens telepek kiválasztásával egy cDNS (telep) génállományt készítünk. A cDNS génállományt ezután telep-hibridizációnak vetjük alá [D. Hanahan és munkatársai: Gene, 10, 63 (1980)1, mintaként az 1. referenciapélda szerint előállított P-jelzett nyúl TNF cDNS fragmenset használva, és a kívánt, humán TNF polipeptidet kódoló beillesztett cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidokat befogadó kiónokra szűrővizsgálatot végzünk. Ha a fenti módon nem kapunk megfelelő TNF cDNS-mintát, a kívánt kiónokra telep-hibridizációs szűrővizsgálatot végzünk, pozitív és negatív indukciós mintákat használva, és hibridizációs transzlációs vizsgálatot, az alábbiak szerint. Az (1) lépés szerint előállított, humán TNF mRNS-t tartalmazó poli(A)mRNS-frakciót vagy dúsított mRNS-frakciót templátként használva 32P-jelzett cDNS-t szintetizálunk, és pozitív indukciós mintaként használjuk. Egy másik mRNS-frakciót - melyet szintén a fentiek szerint állítottunk elő, azzal az eltéréssel, hogy nem indukált makrofágokat használtunk kiindulási anyagként - templátként használva 32P-jelzett cDNS-t szintetizálunk, melyet negatív indukciós mintaként használunk. A fenti módon kapott cDNS génállományból kiválasztjuk azokat a plazmid-klónokat, amelyek a pozitív indukciós mintával erősen hibridizálódnak, de a negatív indukciós mintával nem hibridizálódnak. Annak megerősítésére, hogy a kapott kiónok valóban befogadták a humán TNF polipeptidet kódoló beillesztett cDNS-t, a követekező vizsgálatot végezzük el. A fenti kiónokból izoláljuk a plazmid DNS-eket, melegítéssel vagy lúgos kezeléssel egyszálú DNS-sé alakítjuk, és nitrocellulóz szűrőre visszük. A humán 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
