202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 A 24 1 plazmához 24 g EDTA-t és 240 g celite-t adunk, és az elegyet 1 órán át keverjük, majd egymást követőén 3 mikron, 1 mikron, végül 0,2 mikron pórusméretű szűrőn szűrjük. 24 1 szűrlethez 12 1 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris- HCl-puffert (pH 7,8) adunk, és az elegyet 27*45 cm-es DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) oszlopra viszszük, melyet előzőleg 0,1 mól/1 nátrium- kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) ekvilibráltunk. Az oszlopot ezután 75 1, 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl- pufferrel (pH 7,8), majd 50 1, 0,15 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) mossuk, és végül 0,18 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,2) eluáljuk. Az eluátumból 8 1-es frakciókat szedünk, és a citotoxikus aktivitással rendelkező aktív frakciókat összegyűjtjük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és azonos térfogatú 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) hígítjuk. A hígított oldatot 10*13 cm-es DEAE-Sepharose CL-6B oszlopra visszük. Az oszlopot 1 liter, 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) mossuk, majd 5 1, 0,18 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl- pufferrel (pH 7,2) eluáljuk. Az eluátumból 250 ml-es frakciókat szedünk, és a citotoxikus aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük és egyesítjük. Az aktív frakciót 60 °C-on 30 percen át melegítjük, majd gyorsan 4 °C-ra hűtjük. A lehűtött oldatot ultraszűréssel koncentráljuk. A kapott koncentrátumot 5*80 cm-es Sephacryl S- 200 (Pharmacia) oszlopra visszük, melyet előzőleg 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,005 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,4) ekvilibráltunk, és az oszlopot a fentivel azonos összetételű pufferrel eluáljuk. Az eluátumból 40 ml-es frakciókat szedünk, a citotoxikus aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük és ultraszűréssel koncentráljuk. Az aktív frakciókból gélszűréssel kapott koncentrátumot Zn2+-kelát-Sepharose oszlopra visszük, az alábbi módon. 1,6*20 cm-es oszlopot kelát-Sepharose-zal (imino-diecetsavval fixált gyanta) töltünk meg, melyet J. Porath és munkatársai [Nature, 258, 598 (1975)] módszere szerint állíthatunk elő, majd 120 ml, 1 mg/ml koncentrációjú cink-klorid-oldattal mossuk, végül 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,05 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,4) ekvilibráljuk. Ezután az oszlopra visszük a fenti lépésben kapott koncentrátumot, és azonos összetételű pufferrel eluáljuk. Az oszlopon nem adszorbeálódott frakciókat gyűjtjük. A fenti frakciókban a citotoxikus aktivitást majdnem teljesen visszanyerjük. A fenti lépésben kapott aktív frakciókat koncentráljuk, és 1,5*90 cm-es Toyopearl HW-55 (Toyo Soda Co., Ltd.) oszlopra visszük, melyet előzőleg 0,15 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,005 mól/1 koncentrációjú foszfát-puffenel (pH 7,4) teljesen ekvilibráltunk. Az oszlopot azonos összetételű puffenrel eluáljuk, és az aktív frakciókat egyesítjük. A fenti módon kapott készítményt nevezzük tisztított nyúl plazma TNF-nek. A tisztított nyúl plazma TNF-et a 3. és 4. referenciapéldákban használjuk fel. 3. referenciapélda Nyúl plazma TNF N-terminális és C-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása A 2. referenciapélda szerint előállított tisztított nyúl plazma TNF N-terminális és C-terminális aminosavszekvenciáját az alábbiak szerint határozzuk meg. Az N-terminális aminosavszekvenciát Edman-lebontásos módszerrel határozzuk meg. A kapott feniltiohidantoin-aminosavakat nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel azonosítjuk, Zorbax ODS oszlopot (Du Pont) használva. A C-terminális aminosavszekvenciát enzimatikus módszerrel határozzuk meg, karboxipeptidázokat használva. A tisztított nyúl plazma TNF-et karboxipeptidáz A-val és Y-nal emésztjük, az enzim- szubsztrát arány 1:25, illetve 1:1000. A nyúl plazma TNF C- terminálisáról a kettős emésztés következtében felszabadult aminosavakat az emésztés 2-180 perce között megfelelő időközökben mikro-aminosav-analizátorral (Shimadzu Seisakusho) határozzuk meg. Vizsgálataink szerint a nyél plazma TNF N-terminális és C- terminális aminosavszekvenciája a következő: N-terminális: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-.... C-terminális: ....Val-Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu. 4. referenciapélda Nyúl plazma TNF elleni antitest előállítása A 2. referenciapélda szerint előállított 1,9*105 egység (L- 929) tisztított nyúl plazma TNF-et tartalmazó TNF-oldatot azonos térfogatú Freund-féle komplett adjuvánssal emulgeáljuk, és az emulziót több helyen szubkután módon tengerimalacok hátába injektáljuk. Az állatokat 1, 3 és 6 hét múlva azonos módszerrel immunizáljuk. Ezután 8 hét múlva intraperitoneálisan azonos mennyiségű tisztított nyűi plazma TNF-et injektálunk be, alumínium-hidroxid-géllel együtt. Az első immunizálás után 9 héttel szív-punkciőval levesszük az összes vért, és lecentrifugáljuk. Nyúl plazma TNF elleni antitestet tartalmazó antiszérumot kapunk. Az antiszérumot normál nyúl szérum-protein komponensekkel kapcsolt Sepharose 4B oszlopra visszük. Ezt 3-szor megismételve nyúl plazma TNF-re specifikus tisztított antitestet kapunk. Immunoelektroforézissel és kettős géldiffúziós módszerrel kimutattuk, hogy az antitest csak a tisztított nyúl plazma TNF- fel képez precipitációs vonalat. A kapott tisztított antitest 60 000-szeres hígításban 50%-ban semlegesíteni képes 500 egység (L-929) nyúl plazma TNF citotoxikus aktivitását. Az antitest 1000- szeres hígításban teljesen semlegesíti 50 egység (LM) nyúl plazma TNF citotoxikus aktivitását. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 30
