202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 A lizátumhoz azonos térfogatú 100-szoros hígítású, tisztított nyúl plazma TNF elleni antitestet adunk, melyet a 4. referenciapélda szerint állítottunk elő. Az elegyet 37 °C-on 2 órán át inkubáljuk, majd a reakcióelegy citotoxikus aktivitását a fent leírt módon, célsejtként L-929 sejtet használva meghatározzuk. Kontroll TNF-készítményként a 2. referenciapélda szerint előállított, előzetesen foszfát-puffenrel hígított nyúl plazma TNF-et használunk. Mint az alábbi eredmények mutatják, a humán TNF polipeptid citotoxikus aktivi- 5 tását az antitest nem semlegesítette. Minta Nyúl plazma TNF elleni antitest pHTNFl3 plazmidot befogadó transzformáns lizátuma nyúl plazma TNF Citotoxikus aktivitás* [egység (L-929)/ml] nincs hozzáadva hozzáadva nincs hozzáadva hozzáadva 186,1 191,0 572,3 <0,1 * a citotoxikus aktivitást a vizsgált eredeti oldatminta aktivitásaként adtuk meg. 2. példa Humán TNF polipeptid előállítása Escherichia coli 20 sejtben (1) Expresszió tac promoter szabályozás mellett A klónozott cDNS-t - mint azt az 1. példában említettük - a rekombináns pHTNF13 plazmádból izoláljuk. A cDNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal to- 25 vább emésztjük, hogy a TNF-et kódoló régiótól lefelé eső nem-kódoló régió egy részét lehasítsuk. A kapott DNS-fragmenset (kb. 1100 bázispár) egy pBR322 plazmidból PstI és EcoRI restrikciós endonukleázos emésztéssel előállított nagyobb DNS-fragmensbe il- 30 lesztve olyan rekombináns plazmidot nyerünk, amelyben TNF cDNS és egy tetraciklin-rezisztencia gén van, a fenti plazmidot pHTl 13-nak nevezzük. A biológiailag aktív humán TNF polipeptidet kódoló cDNS-t hordozó pHTT26 expressziós plazmid elő- 35 állítását a 2. ábrán szemléltetjük. A pHTl 13-ból izolált cDNS-t Aval és Hindin restrikciós endonukleázokkal emésztjük, és a kapott DNS- fragmenst (578 bázispár), amely a biológiailag aktív humán TNF polipeptidet kódoló régió nagy részét tar- 40 talmazza (továbbiakban HTNF-fragmensnek nevezzük), poliakrilamid gél-elektroforézissel izoláljuk. A tac promoter régiót magában foglaló DNS-fragmenst az alábbiak szerint izoláljuk. 300 mikrogramm pDR540 plazmid DNS-t [P-L Bi- 45 ochemicalsj Russell, D.R. és munkatársai: Gene, 20, 231 (1982)] 2 ml, 50 mmól/1 nátrium-kloridot, 6 mmól/1 magnézium-kloridot és 6 mmól/1 2- merk’apto-etanolt tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris- HC1- pufferben (pH 7,5) oldunk, és EcoRI és BamHI 50 restrikciós endonukleázokkal 37 'C-on 60 percen át inkubálva emésztjük. Az elegyhez 0,3 mól/1 végkoncentrációban nátrium-kloridot adunk, majd az emésztett DNS-fragmenseket etanolból visszanyerjük. A tac promoter régiót magában foglaló DNS-fragmenst po- 55 liakrilamid gél- elektroforézissel izoláljuk, a hozam 8,3 mikrogramm. A tac promoter fragmenst kémiailag szintetizált 5 ’ -G ATCCATGTCATCTTCTCG AACC 3 ’-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT 60 képletei oligodezoxiribonukleotid adapterrel kapcsoljuk össze. A fenti adapter egy ATG iniciációs kodont és a biológiailag aktív humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciának 5’-terminális részét foglalja magában, és BamHI és Aval kohéziós terminálisokkal rendelkezik. A kapott DNS-fragmenst a továbbiakban tac promoter-adapter-fragmensnek nevezzük. Fentiektől függetlenül, egy kb. 4300 bázispárból álló, nagyobb, ampicillin-rezisztencia gént magában foglaló DNS-fragmenst vágunk ki pBR322 plazmidból, HindlII és EcoRI restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel, és a fragmenst alacsony olvadáspontú agarózt (0,7%) használva, gél-elektroforézissel izoláljuk. A fenti fragmenst a továbbiakban pBR322- Ampr-fragmensnek nevezzük. 1 mikrogramm HTNF-fragmenst és 6 mikrogramm pBR322-Ampr-fragmenst 6,6 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmazó, 66 mmól/1 koncentrációjú Tris-Hclpufferben (pH 7,6) oldunk, és az oldatot 55 'C-on 10 percen át inkubáljuk. Az elegyhez ezután 1 mmól/1 ATP-t és 10 mmól/1 ditiotreitolt, továbbá 168 egység T4 DNS-ligázt adunk, és 22 'C-on 120 percen át inkubáljuk. A kapott DNS-fragmenst fenolos extrakcióval nyerjük vissza, a hozam 4 mikrogramm. 0,8 mikrogramm DNS-fragmenst 0,3 mikrogramm tac promoter-adapter-fragmenssel kapcsolunk össze, a fentiekben alkalmazott körülmények között, azzal az eltéréssel, hogy 63 egység T4 DNS-ligázt használunk. A reakcióelegyet desztillált vízzel 6-szorosára hígítjuk, és azonos térfogatú, kalciummal kezelt E. coli JM103 sejtszuszpenzióval (P-L Biochemicals) elegyítjük. Az elegyet jeges vízfürdőn 20 percen át, majd 42 'C-on 1 percen át, végül szobahőmérsékleten 10 percen át inkubáljuk, és LB-táptalajt adunk hozzá. Az elegyet 37 *C-on 60 percen át rázatjuk. A kapott sejtszuszpenzióból vett mintát 25 mikrogramm/ml ampicillint tartalmazó, LB-táptalajos agar-lemezre rétegezzük, és egy éjszakán át 37 'C-on tenyésztjük. Az ampicillinrezisztens telepeket szelektájuk. A humán TNF polipeptid termelésére képes transzformánsok egyikét JM103/pHTT26-nak nevezzük. 22
