202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 Az E. coli JM103 sejtek kalciumos kezelését az alábbiak szerint végezzük. 5 ml L-táptalajba E. coli JM103 sejteket oltunk, és egy éjszakán át 37 'C-on tenyésztjük. A kapott tenyészet 1 ml-ét 100 ml LB- táptalajba oltjuk, és a tenyésztést 37 'C-on addig folytatjuk, míg a 650 nm-en mért zavarosság eléri a 0,6 értéket. A tenyészetet 30 percen át jeges vízben állni hagyjuk, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük és 50 ml 50 mmól/1 koncentrációjú kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, majd 60 percen át 0 'C-on tartjuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 10 ml, 20% glicerint tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú kalcium-klorid-oldatban újraszuszpendáljuk. A kapott sejtszuszpenziót használjuk kalciummal kezelt E. coli JM103 sejt-szuszpenzióként a fentiekben. A JM103/pHTT26 transzformánst egy éjszakán át 37 'C-on tenyésztjük, LB-táptalajban. A tenyészet 0,5 ml-ét 5 ml friss LB-táptalajba oltjuk, és 37 'C-on 1 órán át tovább tenyésztjük. A tenyészethez ezután 1 mmól/1 végkoncentrációban izopropil-ß-D-tiogalaktozidot adunk, és a tenyésztést 4 órán át tovább folytatjuk. A sejteket összegyűjtjük, és 1 ml, 0,1% lizozimet és 30 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,0) szuszpendáljuk, majd 0 'C-on 30 percen át állni hagyjuk. A szuszpenziót ezután száraz-jég/etanol fürdőn lefagyasztjuk, majd 37 ‘C-on felolvasztjuk, és a fagyasztás-felolvasztás műveletét 6-szor megismételjük, a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítva tiszta lizátumot kapunk. A lizátumot citotoxikus aktivitása 9,9« 104 egység (L-929)/ml. A fenti citotoxikus aktivitást nem semlegesítette a 4. referenciapélda szerint előállított, nyúl plazma TNF elleni antitest, ami azt bizonyítja, hogy a humán TNF polipeptid nem ad immunológiai keresztreakciót nyúl plazma TNF-fel. (2) Expresszió trp promoter szabályozás mellett A pHTR91 expressziós plazmidot a 3. ábrán szemléltetett eljárással állítottuk elő. A pHTl 13 rekombináns plazmidot Aval és Sáli restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel 3, körülbelül 800, 1300, illetve 2600 bázispárt tartalmazó fragmensre hasítjuk. Az 1300 bázispárból álló DNS- fragmenst, amely a biológiailag aktív humán TNF polipeptidet kódoló régió túlnyomó részét, és a tetraciklin- rezisztencia gén egy részét tartalmazza, és melyet a továbbiakban Aval-Sall-fragmensnek nevezünk, izoláljuk, és egy kémiailag szintetizált, 5 ’ -CGATATGTCATCTTCTCGAACC 3 ’ -TATAC AGTAG A AG AGCTTGGGGCT képletű oligodezoxiribonukleotid adapterrel - továbbiakban I. adapterrel - kapcsoljuk össze. A kapott DNS-fragmenst a továbbiakban HTNF- adapter-fragmensnek nevezzük. Ettől függetlenül, a pDR720 plazmidból [P-L Biochemicals; Russell, D.R. és munkatársai: Gene, 20, 231 (1982)] EcoRI és Hpal restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel kihasítjuk a trp promoter régió egy részét magában foglaló, 35 bázispárt tartalmazó DNS-fragmenst, és egy kémiailag szintetizált, 5 ’-AACTAGTACGC AAGTTCACGTAAAAAG GGTAAT 3 ’-TTGATCATGCGTTCAAGTGCATmTCCC ATTAGC képletű adapterrel kapcsoljuk össze. A kapott DNS- fragmenst a továbbiakban trp promoter-fragmensnek nevezzük. A pBR322 plazmidot EcoRi és Sáli restrikciós endonukleázokkal emésztjük, és a nagyobb, kb. 3700 bázispárt tartalmazó DNS- ffagmenst izoláljuk. A fenti DNS-ffagmensek, azaz a HTNF- adapter-fragmens, a trp promoter-fragmens és a nagyobb pBR322 fragmens szekvenciális kapcsolásával egy pHTR91 expressziós plazmidot kapunk. Az expressziós plazmidot az (1) pontban leírt módon E. coli HB101 sejtekbe visszük be, a transzformánsok egyikét HB101/ pHTR91-nek nevezzük. A HB101/pHTR91 transzformánst egy éjszakán át 37 'C-on módosított M-9 táptalajban (összetétel: 0,7% dinátrium-hidrogén- foszfát* 12H20, 0,3% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,05% nátrium-klorid, 0,1% ammónium-klorid, 2 mg/1 Bi-vitamin, 0,45% kazaminosav, 1 mmól/1 magnézium-szulfát, 0,1 mmól/1 kalcium-klorid és 0,5% glükóz) tenyésztjük. A tenyészet 0,05 miével 5 ml azonos összetételű táptalajt oltunk be, és 37’C-on 1 órán át tenyésztjük. A tenyészethez ezután 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban 3-ß-indolakrilsavat adunk, és a tenyésztést 4 órán át folytatjuk. A sejteket az (1) pontban leírtak szerint összegyűjtve és kezelve tiszta lizátumot kapunk. A lizátumot citotoxikus aktivitása 1,01*106 egység (L- 929)/ml. . (3) Expresszió phoS promoter szabályozás mellett A szignál-peptiddel, és egy foszfát-kötő protein N- terminális részével fuzionált humán TNF polipeptidet termelésére képes, és a fuzionált proteint a gazdasejt periplazmájába ürítő pHTS115 expressziós plazmid előállítására szolgáló eljárást a 4. ábrán szemléltetjük. A (2) pontban leírt módon kapott Aval-SalI-fragmenst egy kémiailag szintetizált, 5 ’ -G ATCCATGTCATCTTCTCG AACC 3 ’ -GTACAGTAG A AG AGCTTGGGGCT képletű oligodezoxiribonukleotiddal kapcsoljuk. Az összekapcsolt DNS-fragmens BamHI restrikciós endonukleázzal emésztve mindkét végén BamHI kohéziós terminálissal rendelkező DNS fragmenst - továbbiakban HTNF-Tetr*BamHI-fragmensnek nevezzük - állítunk elő. Fentiektől függetlenül, egy phoS-gént tartalmazó pSN5182 plazmidot [Morita, T. és munkatársai: Eur. J. Biochem., 130, 427 (1983)] Hpal és EcoRi endonukleázokkal emésztve olyan, kb. 4000 bázispárt tartalmazó, phoS promoter régiót és Shine-Dalgamoszekvenciát magában foglaló DNS-fragmenst állítunk elő, amely a szignál- peptidet és a foszfát-kötő protein N-terminális szakaszát kódoló DNS-szekvenciát, továbbá a tetraciklin-rezisztencia gént tartalmazza. A fenti DNS-fragmenst a továbbiakban Hpal-EcoRI-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 23
