202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 rid és 1 g glükóz/1 liter táptalaj; pH 7,2) tenyésztjük, míg a tenyészet zavarossága eléri a 0,5 értéket 600 nm-en. A sejteket 4 °C-on centrifugálással összegyűjtjük és 10 ml, 50 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,3) mossuk. A sejteket 2 ml azonos összetételű pufferben szuszpendáljuk, és 0 ‘C-on 5 percen át állni hagyjuk. 0,2 ml fenti szuszpenzióhoz 0,1 ml (5) lépésben kapott rekombináns plazmid-oldatot adunk. Az elegyet 0 °C- on 15 percen át állni hagyjuk, s majd 2 percen át 42 °C-on tartjuk. Ezután hozzáadunk 0,5 ml kiegészített L-táptalajt, és a sejteket 1 órán át rázatva tenyésztjük. A tenyészetből mintát veszünk, 15 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmazó, kiegészített L-táptalajos agarlemezre rétegezzük és 37 °C-on 12 órán át tenyésztjük. A cDNS génállományt a tetraciklin-rezisztens transzformált sejtek kiválasztásával kapjuk. (7) Humán TNF cDNS klónozása A fenti módon kapott cDNS génállományból telephibridizációs vizsgálattal választjuk ki a humán TNF polipeptidet kódoló cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidot befogadó transzformált sejteket, a hibridizálásra mintaként nyúl TNF-et kódoló klónozott cDNS-ből előállított DNS-fragmenseket használunk. Közelebbről, a nyúl TNF-et kódoló cDNS-t az 1. referenciapéldában leírtak szerint izoláljuk rekombináns pRTNF802 plazmidból. Bázisszekvenciája a 3. táblázatban látható. A cDNS-t Aval vagy Haell restrikciós endonukleázzal emésztjük. Az emésztett DNS- fragmenseket etanolból kicsapva nyerjük vissza. A kívánt DNS-fragmenseket poliakrilamid gél-elektrofonázissel izoláljuk. A 3. táblázatban látható, 285-583. bázisszekvenciának megfelelő DNS-fragmenset (299 bázispár) Aval restrikciós endonukleázzal végzett lebontással kapjuk, és a továbbiakban Aval-fragmensnek nevezzük. A 3. táblázat 33-120. bázisszekvenciájának megfelelő másik DNS-ffagmenset (88 bázispár) Haell restrikciós endonukleázzal végzett emésztéssel nyerjük, a továbbiakban Haell-fragmensnek nevezzük. Az Aval-fragmenst és Haell-fragmenst 32P-vel jelezzük. A jelzett DNS-fragmenseket használjuk mintaként a humán TNF polipeptidet kódoló cDNS-t tartalmazó plazmidot befogadó transzformált sejtek kiválasztására a cDNS génállományból, a Hanahan és Meselson Gene, 10, 63 (1980) módszere szerint végzett telep-hibridizációs vizsgálatban. Közel 20 000 klón közül 43 kiónt szelektáltunk az első vizsgálatban, P-jelzett Aval-ffagmenset használva mintaként. A kapott 43 kiónt a második vizsgálatban mintaként 32P-jelzett Haell-fragmenssel hibridizáltuk. Végül 6 olyan cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidot befogadó klőnt szelektálunk, amely erősen hibridizált mind a kétféle nyúl TNF cDNS-fragmenssel. 8 * * * (8) Expresszió A (7) lépésben leírtak szerint szelektált hat transzformáit kiónból Wilkie és munkatársai [Nucleic Acid Res., 7, 859 (1979)] módszere szerint izoláltuk a rekombináns plazmid DNS-eket, melyeket pHTNFl, pHTNF4, pHTNF5, pHTNF13, pHTNF22, illetve pHTNF26 plazmidnak neveztünk el. Minden egyes rekombináns plazmidot E. coli HB101 törzsbe viszünk be, a (6) lépésben leírt módon, a rekombináns plazmidokat befogadó transzformált sejtek előállítása céljából. A transzformált sejteket 50 ml LB-táptalajban (öszszetétel: 10 g tripton, 5 g élesztőkivonat és 10 g nátrium-klorid/1 liter táptalaj; pH 7,5) tenyésztjük, míg a tenyészet zavarossága 600 nm-en eléri a 0,8 értéket. Ezután a kb. 3-5*1030 sejtet összegyűjtjük, és Nagata és munkatársai [Nature, 284, 316 (1980)] módszere szerint lizáljuk, csekély változtatással. A sejteket 1 ml, 0,1% lizozimet és 30 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,0) újraszuszpendáljuk. A szuszpenziót 30 percen át jeges vízben állni hagyjuk, majd a sejteket hatszor megismételt fagyasztással és felolvasztással feltárjuk. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítva tiszta lizátumot kapunk. A transzformált sejtekből a fenti módon előállított lizátumot L-929 sejteket használva citotoxikus aktivitás szempontjából megvizsgáltuk. Vizsgálataink szerint a pHTNFl3 plazmidot befogadó transzformánsból előállított lizátum citotoxikus aktivitása 186,1 egység (L-929)/ml. (9) Klónozott cDNS bázisszekvenciájának meghatározása A pHTNF13 rekombináns plazmidot a fent leírt módon izoláljuk. A plazmid DNS-t PstI restrikciós endonukleázzal hasítva izoláljuk a vektorba illesztett klónozott cDNS-t. A klónozott cDNS-fragmenst különféle restrikciós endonukleázokkal tovább hasítjuk, és a kapott 16 fragmens bázisszekvenciáját Maxam-Gilbert módszerrel meghatározzuk. Az 1. ábra a fragmensek előállítására használt restrikciós endonukleázok hasítási helyeit mutatja, és a szekvenciameghatározás irányát a nyilak jelzik. A bekeretezett terület a humán TNF prekurzor polipeptidet kódoló régiót jelenti. A meghatározott bázisszekvenciát, és az abból következtetett aminosavszekvenciát a 4. táblázat mutatja. A humán TNF polipeptidet kódoló régiót a nyúl TNF-et kódoló bázisszekvenciával mutatott homológia alapján határozzuk meg. A humán TNF polipeptidet kódoló DNS kódolja a 233 aminosav-maradékból álló prekurzor polipeptidet. A biológiailag aktív humán TNF polipeptid a prekurzor polipeptid karboxil-végétől számított 155 aminosav-maradékból álló polipeptidnek felel meg, amelyet a 4. táblázat 235-699. bázisából álló bázisszekvencia kódol (a 4. táblázatban a zárójelbe tett régió). A humán TNF polipeptidet kódoló utolsó kodont követű terminációs kodon egy TGA kodon. (10) A humán TNF polipeptid immunológiai tulajdonságai A fenti módon kapott lizátumban a humán TNF polipeptid nyúl plazma TNF elleni antitesttel adott immunológiai keresztreakcióját az alábbiak szerint vizsgáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 21
