202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 nopus laevis oocitáiba. 10 oocitát 100 mikroliter Barthtáptalajban [J.B. Gurdon; J. Embryol. Exp. Morphol., 20, 401 (1968)] 22 'C-on 24 órán át inkubálunk. Az oocitákat homogenizáljuk és 10000 fordulat/perc sebességgel 10 percen át centrifugáljuk. A felülúszó TNF-aktivitását úgy határozzuk meg, hogy mérjük az egér L- 929 sejtekre kifejtett citotoxikus aktivitást. Az egér L-929 sejtekkel szembeni citotoxikus hatást az alábbiak szerint mérjük. 0,1 ml mintát az alább említett táptalajjal sorozathígítunk, majd a 96 lyukú lemez (Flow Labs.) minden egyes lyukába 0,1 ml, 5*105 sejt/ml töménységű L-929 sejt-szuszpenziót mérünk. Táptalajként 1% magzati marhaszérumot tartalmazó Eagle-féle minimáltáptalajt használunk. A lemezt 38,5 'C-on 18 órán át inkubáljuk, 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben. Az élő L-929 sejtek számát, és a biológiai aktivitás kiszámítását ugyanúgy végezzük, mint azt a [III-2-(l)] fejezetben az egér L-M sejtekkel végzett citotoxikus aktivitás meghatározásával kapcsolatban már leírtuk. A fenti módon, egér L-929 sejtekre kifejtett citotoxikus aktivitást egység (L-929)-ként adjuk meg, az egér L-M sejtekkel szembeni citotoxikus hatástól való megkülönböztetés miatt. A fenti módon előállított felülúszó citotoxikus aktivitása 6,6 egység (L-929)/ml. Ez azt jelenti, hogy a po!i(A)-mRNS készítmény TNP mRNS-t tartalmaz. (2) cDNS szintézis Az (1) lépésben kapott poli(A)mRNS-t templátként használva a komplementer DNS-t Gubler és Hoffman [Gene, 25, 263 (1983)] módszere szerint szintetizáljuk. 6 mikrogramm poli(A)mRNS-t 40 mikroliter, 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 10 mmól/1 ditiotreitolt, 4 mmól/1 nátrium-pirofoszfátot, 1,25 mmól/1 dGTP-t, 1,25 mmól/1 dATP-t, 1 25 mmól/1 dTTP-t, 0,5 mmól/1 dCTP-t, 167 nmól/1 a 2P-dCTP-t (fajlagos radioaktivitása 3000 Ci/mmól), 4 mikrogramm oligo(dT)i2-i8- at és 120 egység reverz transzkriptázt (madár mieloblasztózis vírusból (AMV)] tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,3) oldunk, és az oldatot 43 'C-on 30 percen át inkubáljuk. Ezután a reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet 1:1 arányú fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és a vizes fázishoz 2,5 mól/l végkoncentrációban ammónium-acetátot adunk. A kapott cDNS-mRNS hibridet a vizes fázisból etanolos kicsapással nyerjük vissza. A cDNS-mRNS hibrid csapadékot 100 mikroliter, 5 mmól/1 magnézium-kloridot, 10 mmól/1 ammónium-szulfátot, 100 mmól/1 kálium-kloridot, 0,15 mmól/1 ß-nikotinamid-adenin- dinukleotidot, 5 mikrogramm marha szérumalbumint, 0,04 mml/1 dGTP-t, 0,04 mmól/1 dATP-t, 0,04 mmól/1 dTTP-t, 0,04 mmól/1 dCTP-t, 0,9 egység E. coli ribonukleáz H-t és 23 egység E. coli DNS-polimeráz I-et tartalmazó 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,5) oldjuk, és 12 "C-on 60 percen át, majd 22 'C-on 60 percen át inkubálva dscDNS-t szintetizálunk. A reakciót EDTA hozzáadásával állítjuk le. A dscDNS-t fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és etanolból kicsapva nyerjük vissza, mint azt fent leírtuk. (3) Oligo(dC)-végű cDNS előállítása A fenti lépésben kapott dscDNS-t 100 mikroliter, 2 mmól/1 kobalt-kloridot, 0,2 mmól/1 ditiotreitolt, 0,1 mól/l a-32P-dCTP-t (fajlagos radioaktivitása 3 Ci/mmól), és 10 egység terminális dezoxinukleotidiltranszferázt tartalmazó 100 mmól/1 koncentrációjú nátrium-kakodilát-pufferben (pH 7,2) oldjuk, és 37 'C-on 30 percen át inkubáljuk, hogy a dscDNS 3’-végéhez hozzákapcsolódjon az oligo(dC)-vég. A reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. Az oligo(dC)-végű dscDNS-t fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és etanolból kicsapva visszanyerjük. Az oligo(dC)-végű dscDNS-t 2 mikrogramm/ml végkoncentrációban 1 mmól/1 EDTA-t, és 100 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris- HCl-pufferben (pH 7,4) oldjuk. (4) Oligo(dG)-végü pBR322 DNS előállítása 10 mikrogramm pBR322 DNS-t mikroliter, 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 50 mmól/1 ammóniumszulfátot és 10 mikrogramm marha szérumalbumint tartalmazó 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,4) oldunk, és 15 egység restrikciós endonukleáz Pstl-et adunk hozzá. Az elegyet 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. A reakció befejeződése után a reakcióelegyet fenol-kloroform eleggyel extraháljuk és a vizes fázisból a kapott DNS-t etanolból végzett kicsapással nyerjük vissza. A kapott DNS-t 200 mikroliter, a dscDNS oligo(dC)-véggel való ellátásánál használt pufferével azonos összetételű, de még 80 egység terminális dezoxinukleotidil-transzferázzal kiegészített, és 32P-dCTP helyett 3H-dGTP-t tartalmazó pufferben oldjuk, és 37 °C-on 20 percen át inkubálva a 3’-véghez egy 10-15 dezoxiguanilsav-maradékból (dG) álló végcsoportot kapcsolunk. A reakcióelegyet fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és az oligo(dG)végű pBR322 DNS-t a vizes fázisból etanolból végzett kicsapással visszanyerjük. A kapott, végcsoporttal ellátott pBR322 DNS-t az oligo(dC)-végű dscDNS oldására használt pufferével azonos öszetételű pufferben oldjuk, 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban. (5) Rekombináns plazmid előállítása 120 mikroliter oligo(dC)-végű cDNS-oldatot azonos térfogatú oligo(dG)-végű pBR322 DNS-oldattal elegyítünk, és az elegyet 65 'C-on 5 percen át, majd 57 'C-on 120 percen át inkubálva hőkezeljük, és kialakítjuk a rekombináns plazmidot. (6) Transzformált sejtek kiválasztása A fenti módon kapott rekombináns plazmiddal E. coli %1776 törzset transzformálunk, az alábbiak szerint. Az E. coli X\116 törzset 20 ml, 100 mikrog- 1 ramm/ml diamino-pimelinsavval és 40 mikrogramm/ml timidinnel kiegészített L-táptalajban (összetétel: 10 g tripton, 5 g élesztőkivonat, 5 g nátrium-klo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 20
