202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 [ffl-3] Immunológiai sajátságok 100 egység (LM)/ml koncentrációjú rHu-TNF-oldatot azonos térfogatú, 100-szoros hígítású, tisztított nyúl plazma TNF elleni antitesttel kevertünk össze, melyet a 4. referencia példa szerint állítottuk elő. 37 *C-on 2 órás inkubálás után a fent ismertetett módon, célsejtként L-M sejteket használva meghatároztuk a reakcióelegy citotoxikus aktivitását. Vizsgálati eredményeink szerint a rHu-TNF citotoxikus hatását az antitest egyáltalán nem semlegesítette, ebből a tényből arra következtethetünk, hogy a humán TNF polipeptid immunológiailag megkülönböztethető a nyúl TNF-től. [IV] A találmány szerinti eljárással előállított polipeptideket oldat vagy liofilizett termék formájában állíthatjuk elő, amelyekből gyógyszerkészítményeket készíthetünk. A hosszú távú stabilitás szempontjából kedvezőbb, ha a termék liofilezett formában van. A termékhez előnyösen hordozóanyagot és stabilizálószereket is adunk. Stabilizálószerként például albumint, globulint, zselatint, protamint, protaminsókat, glükózt, galaktózt, xilózt, mannitot, glukoronsavat, trehalózt, dextránt, hidroxi-etil-keményítőt, és nemionos felületaktív szereket - például poli(oxi-etilén)-zsírsavésztereket, poli(oxi-etilén)-alkil-étereket, poli(oxi-etilén)-alkil-fenil-étereket, poli(oxi-etilén)-szorbitán-zsírsav-észtereket, poli(oxi-etilén)-glicerin-zsírsav-észtereket, poli(oxi-etilén)-hidrogénezett ricinusolajat, poli(oxi-etilén)-ricinusolajat, poli(oxi-etilén)-poli(oxipropilén)-alkil-étereket, poli(oxi-etilén)-poli(oxi-propilén) blokk-kopolimereket, szorbitán, zsírsav-észtereket, szacharóz-zsírsav-észtereket és glicerin-zsírsavésztereket - használhatunk. [V] A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek tumorsejtekkel szemben szelektív citotoxikus hatással rendelkeznek, és tumoros állatokban a tumort visszafejlesztik, fenti hatásuk következtében gyógyszerkészítmények hatóanyagaként tumorellenes szerként használhatók. A polipeptid készítményeket parenterálisan vagy helyileg alkalmazhatjuk. Parenterális - például intravénás vagy intramuszkuláris - alkalmazást akkor választunk, ha a tumorsejtek nagy területen szóródtak szét vagy metasztázisban vannak, vagy a metasztázist akarjuk megakadályozni. Helyi tumoros szöveteket előnyösen közvetlen intratumoros alkalmazással kezelünk. A dózis a tumorok típusától és nagyságától, a beteg állapotától és az alkalmazás módjától függően változik. Rendszerint a dózis M02 - lxlO7 egység (LM)/kg, előnyösen M03 - 1*106 egység (LM)/kg. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák és referenciapéldák segítségével kívánjuk ismertetni a korlátozás szándéka nélkül. A példák könnyebb megértése céljából a leírást az 1-5. ábrákkal is kiegészítettük. Az 1. ábra a DNS-fragmensek előállítására használt restrikciós endonukleáz hasítási helyeit mutatja, és a humán TNF polipeptidet kódoló klónozott cDNS bázisszekvenciájának meghatározása során a szekvenálás irányát és mértékét [l-(9). példa]. A 2. ábrán a pHTT26 expressziós plazmid kialakítására szolgáló eljárást mutatjuk be [2-(l). példa]. A 3. ábra a pHTR91 expressziós plazmid kialakítására szolgáló eljárást szemlélteti [2-(2). példa]. A 4. ábrán a pHTS115 expressziós plazmid előállítási eljárása látható [2-(3). példa]. Az 5. ábra a pHTS37 expressziós plazmid előállítási eljárását mutatja [2-(4). példa]. 1. példa (1) TNF mRNS előállítása humán alveolusz makrofágokból A humán alveoláris makrofágokat foszfáttal pufferolt sóoldattal végzett broncho-alveoláris öblítéssel gyűjtjük össze. Az alveoláris makrofágokat - 6,3* 107 sejtet - 10% magzati marhaszérumot tartalmazó RPMI-1640 táptalajban szuszpendáljuk, és 8 cm átmérőjű Petri-csészére oltjuk, 9*106 sejt/csésze sejtsűrűséget biztosítva. A tenyészetet 37 'C-on 1 órán át előtenyésztjük, 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben. Ezután a csészékbe 10 mikrogramm/ml végkoncentrációban endotoxint (E. coliból származó lipopoliszacharidot), 10 ng/ml végkoncentrációban TPA-t (fórból-12-mirisztát-l3-acetátot) és 1 mikrogramm/ml végkoncentrációban cikloheximidet (proteinszintézis-inhibitor) mérünk. A tenyésztést 4- 4,5 órán át tovább folytatjuk (a teljes tenyésztési idő 5-5,5 óra). A tápfolyadékot leszívatjuk, és a csészéhez tapadt makrofágokat 0,6% nátrium-N-lauroil-szarkozinátot és 6 mmól/1 nátrium-citrátot tartalmazó 5 mól/1 koncentrációjú guanidil-tiocianát-oldattal lizáljuk és homogenizáljuk. A homogenizátumot 0,1 mól/1 EDTA- t tartalmazó 5,7 mól/1 koncentrációjú cézium-kloridoldatra öntjük, és 20 órán át 26 500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, ultracentrifugában (RPS27-2 rotor, Hitachi Koki), a teljes RNS-ffakciót szemcse formájában kapjuk. A szemcséket kis mennyiségű, 0,35 mól/1 nátrium-kloridot, 20 mmól/1 Tris-HCl-t (pH 7,4) és 20 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 7 mól/1 koncentrációjú karbamidoldatban oldjuk, és etanolból kicsapva visszanyerjük. 159 mikrogramm össz-RNS-t kapunk a fenti módon. -Az össz-RNS-ffakciót 1 ml, 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,4) - továbbiakban TE-oldatként említjük - oldjuk, és az oldatot 65 °C-on 5 percen keresztül melegítjük. Az oldathoz 0,5 mól/1 végkoncentrációban nátrium-klorid-oldatot adunk, és az elegyet előzőleg 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó TE-oldattal ekvilibrált oligo(dT)-cellulóz-oszlopra visszük. Az oszlopról TE-oldattal 8 mikrogramm poli(A)mRNS-t eluálunk. A poli(A)mRNS-t 1,9 ng/nl koncentrációban desztillált vízben oldjuk, és az oldatot mikroinjekciós módszerrel közel 50 nl/oocita dózisban beinjektáljuk a Xe-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 19
