202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 zati marhaszérummal kiegészítve. A lemezt 37 'C-on 48 órán át inkubáltuk, 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben. Az inkubálás befejeztével az élő sejteket 20 mikroliter 25%-os glutáraldehid hozzáadásával fixáltuk. A fixálás után a lemezt mostuk és szárítottuk. Ezután a fixált sejteket 0,1 ml 0,05%-os metilénkék-oldattal megfestettük. A metilénkék feleslegét lemostuk, és a lemezt szárítottuk. A fixált sejtekhez kötődött metilénkéket 200 mikroliter 0,36 n sósavoldattal eluáltuk, és a 665 nm-nél mutatott abszorpciót Titerek Multiscan (Flow Labs.) fotométerrel mértük. Az abszorpció az élő sejtek számával arányos. Az L-M sejtek 50%-ának elpusztításához szükséges koncentrációt mint 1 egység/ml-t definiáltuk. A fenti módon meghatározott, egér L-M-sejtekkel szembeni citotoxikus aktivitást a egér L-929 sejtekre kifejtett citotoxikus aktivitástól való megkülönböztetés céljából mint egység (LM)- et adjuk meg. A proteintartalmat Lowry, O.H. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 193, 265 (1951)] módszere szerint határoztuk meg. Vizsgálataink szerint a rHu-TNF specifikus aktivitása 2«106 egység (LM)/mg protein, vagy még ennél is magasabb érték. (2) Egérbe transzplantált Meth A szarkóma elleni hatás A tumorellenes hatást Meth A szarkómát hordozó egéren az alábbiak szerint vizsgáltuk. 23 g átlagos súlyú BALB/c egerekbe a hasi bőr alá 2*105 Meth A szarkóma sejtet ültettünk be intradermálisan. Hét nap múlva kiválogattuk azokat az egereket, amelyekben a tumor átmérője 6-7 mm volt. A tumor beültetése utáni 7. napon a tumorba, vagy intravénásán bevittük a rHu-TNF-et. A rHu-TNF endotoxon-tartalma kisebb, mint 0,01 ng/MO4 egység (LM). Abban az esetben, mikor a tumorba magába vittük be a rHu-TNF-et, M03, 3*103 és 1*104 egység (LM)/egér dózisban, 24 órával az injektálás után minden egérben tumomekrózist észleltünk, és a tumor az egyes dózisok alkalmazása esetén 3/5, 5/5, illetve 5/5 arányban teljesen visszafejlődött. Intravénás kezelés esetén 3*l(r és 1 * 104 egység (LM)/egér dózisok alkalmazása mellett minden egérben észleltük a nekrotikus választ, a teljes visszafejlődés aránya 3/5, illetve 4/5 volt. (3) rHu-TNF humán tumor-sejtekre kifejtett gátló hatása in vitro A rHu-TNF humán tumor-sejtekre és normál sejtekre kifejtett növekedésgátló hatását in vitro az alábbiak szerint vizsgáltuk. 24 lyukú lemez minden egyes lyukába 1 ml, 10% magzati maihaszérumot tartalmazó Eagle-minimáltáptalajt mértünk, és lyukanként 1*104 sejttel - humán tumor-sejttel vagy normál sejttel - beoltottuk. A rHu- TNF-et 100 egység (LM)/ml végkoncentrációban hozzáadtuk, és a sejteket 37 °C-on 4 napon át inkubáltuk, 5% szén-dioxidot tartalmazó teljesen telített páratartalmú légtérben. A tenyésztés befejezte előtt 4 órával minden lyukba 1 mikrocurie 3H-timidint adtunk. A tenyésztés befejezése után a sejteket foszfát-pufferes sóoldattal mostuk, és 0,5% nátrium-dodecil-szulfáttal lizáltuk. A sejtekbe beépült H-timidin mennyiségét a lizátum radioaktivitásának mérésével határoztuk meg. Az inhibitor hatást, melyet a növekedésgátlás arányával adtunk meg, a következő egyenlet segítségével számoltuk ki: Növekedésgátlás aránya (%) - (a-b)/a • 100, ahol a az rHu-TNF távollétében, b az rHu-TNF jelenlétében beépült radioaktivitást jelenti. Az eredményeket a 8. táblázatban foglaltuk össze: A fenti eredmények azt mutatják, hogy a rHu-TNF jelentős mértékben gátolja a humán tumor-sejtek növekedését, míg a normál sejtekre nézve hatástalan. A fentiek szerint a rHu-TNF szelektíven a tumoros sejteket támadja meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 8. táblázat Humán sejt Eredet Növekedésgátlás aránya (%) Normál sejtek WI-38 (ATCC CCL 75) tüdő diploid nincs gátlás MRC-5 (ATCC CCL 171) tüdő diploid nincs gátlás IMR-90 (ATCC CCL 186) tüdő diploid nincs gátlás Tumor-sejtek G-361 (ATCC CRL 1424) melanoma 75 HT-1376 (ATCC CRL 1472) hólyag karcinóma 49 ZR-75-1 (ATCC CRL 1500) mell karcinóma 97 HŐS (ATCC CRL 1543) csont szarkóma 47 WiDr (ATCC CCL 218) vastagbél adenokarcinóma 37 MCF7 (ATCC HTB 22) mell adenokarcinóma 69 G-402 (ATCC CRL 1440) vese leiomioblasztóma 98 PANC-1 (ATCC CRL 1469) hámszerű karcinóma 59 HeLa (ATCC CCL 2) hámszerű karcinóma 31 18
