202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 kevesebb interferon ffagmenst vagy fragmenseket tartalmaznak, mint az ismert, hatóanyagként érett rekombináns humán immun interferont tartalmazó kompozíciók. A kisebb hatóanyagtartalom a találmányunk szerint előállított rekombináns immun interferon fragmensek által kifejtett lényegesen nagyobb fajlagos vírusellenes aktivitáson alapul' (lásd: 1. táblázat, egység/ml-ben). A találmányunk szerinti előnyös rekombináns immun interferon fragmenseket tartalmazó készítmények csökkentett hatóanyagtartalmát az 1. táblázatban megadott fajlagos vírusellenes hatástani adatok felhasználásával számítjuk ki. A csökkentett hatóanyagtartalmat az alábbiakban közöljük: IFN-y(-6) rekombináns immun interferon fragmens esetében 23 % IFN-y(-8) rekombináns immun interferon fragmens esetében 16 % IFN-y(-ll) rekombináns immun interferon fragmens esetében 14 %. így tehát a fenti három, találmányunk szerinti rekombináns immun interferon fragmens alkalmazása esetén ugyanazon fajlagos vírusellenes aktivitás kifejtéséhez az érett rekombináns immun interferon (100 %) mennyiségének 23 %-a, 16 %-a, illetve 14 %-a elegendő. A 2. táblázat adatait felhasználva hasonló eredményeket kapunk. A gyógyászati készítményeket a gyógyszergyártás önmagukban ismert módszereivel állíthatjuk elő. A hatóanyagot az alábbi formákban készíthetjük el: a) Orális adagolásra szolgáló szilárd készítmények (pl. tabletták, kapszulák, pirulák, porkeverékek, szemcsék stb.). b) Orális adagolásra szolgáló folyékony készítmények (pl. oldatok, szirupok, szuszpenziók, elixírek stb.). c) Parenterális adagolásra alkalmas készítmények (pl. steril oldatok, szuszpenziók vagy emulziók). d) Helyi kezelésre alkalmas készítmények (pl. oldatok, szuszpenziók, kenőcsök, krémek, gélek, mikronizált porok, aeroszolok stb.). A gyógyászati készítmények sterilezhetők és/vagy adjuvánsokat (pl. tartósító-, stabilizáló-, nedvesítő-, emulgeálószereket, az ozmózisnyomás változását elősegítő sókat és/vagy puffereket) tartalmazhatnak. A parenterális adagolásra alkalmas készítmények intravénásán vagy intramulzkulárisan befecskendezhető infúziók vagy injekciós oldatok lehetnek. Ezek a készítmények további gyógyászati hatóanyagokat is tartalmazhatnak, valamint további adalékokat (pl. tartósító-, stabilizáló-, emulgeálószereket, puffereket stb.). E gyógyszerkészítmények előállítása a gyógyszergyártás önmagukban ismert módszereivel történik. A találmányunk szerint előállított rekombináns immun interferon fragmenseket tartalmazó gyógyászati készítmények vírusos fertőzések, neoplázisos betegségek vagy reuma tóid arthritis kezelésére alkalmazhatjuk. A gyógyászati készítményeket orálisan, injekció útján vagy helyi kezeléssel alkalmazhatjuk. Az adagolás módja és az alkalmazott dózistartomány az ismert interferonok klinikai felhasználásával kapcsolatban kialakult gyakorlatnak felel meg és általában kb. 10 egység/nap. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények a rekombináns immun interferon fragmens mellett gyógyászatiig alkalmas inert hordozóanyagot tartalmaznak. E célra bármely megfelelő szokásos hordozóanyag felhasználható. így szerves vagy szervetlen inert enterális, perkutáns vagy parenterális adagolásra alkalmas hordozóanyagokat alkalmazhatunk [pl. vizet, zselatint, gumiarábikumot, laktózt, keményítőt, megnézium-sztearátot, talkumot, növényi olajokat, poli(alkilénglikol)-okat, vazelint stb.]. A gyógyászati készítmények ezenkívül további gyógyászati hatóanyagokat, valamint egyéb adalékanyagokat (pl. ízesítő-, tartósító-, stabilizáló-, emulgeálószereket, puffereket stb.) is tartalmazhatnak, a gyógyszeriparban kialakult gyakorlatnak megfelelően. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. 1. példa A. Elvek Érett rekombináns immun humán interferon és a találmányunk szerinti rekombináns immun interferon fragmensek kifejezésére pDS8/RBSII,SphI-t alkalmazunk. A hatékony kifejezés céljából a fent említett vektor kifejezési kontroll szekvenciaként Pn25*/0 szabályozható promotor/operátor elemet [Stüber et al., EMBO J. 3, 3143-3148 (1984)] és RBSn,SphI riboszóma helyet tartalmaz. A riboszóma helyet DNS szintézisen keresztül a riboszóma helynek E. coli fág T5 promotor PG25 [R. Gentz, Ph.D. thesis, University of Heidelberg, FRG (1984)] ellenőrzése alatt történő kialakításával származtatjuk le. A fenti kifejezési szignálok nagyfokú hatékonysága következtében a nevezett vektor E.coli-ban csak akkor tartható fenn stabilan, ha a promotor/operátor elemet lac represszomak a Pn25*/0 operátor egységhez való kötésén keresztül represszáljuk. A lac represszort a lacl gén kódolja. A Pn25*/o csak abban az esetben represszálható hatékonyan, ha megfelelő mennyiségű represszor molekula van jelen. Ezért lacf5 allélikus változatot alkalmazzuk, amely a represszor gén fokozott kifejezésére mutáns promotort tartalmaz. A lacl*1 alléit a plazmid pDMI.l tartalmazza (4. ábra). Ez a plazmid az lacl génen kívül a kanamicinnel szembeni rezisztenciát biztosító neogént tartalmazza (szelektív marker). A pDMI.l plazmid kompatibilis a pDS8/RBSII,SphI kifejezési vektorral. A kifejező vektor stabil fenntartásának biztosítása céljából a pDS8/RBSII,SphI alapú kifejező vektorokkal transzformáit E.coli sejteknek be kell fogadni a pDMI.l-et. Ebben a rendszerben a kifejezés könnyen indukálható oly módon, hogy a közeghez kívánt sejtsűrűség mellett IPTG-t adunk. B. pDS8/RBSII,SphI plazmid A pDS8/RBSII,SphI (2. ábra) azon része, amely a restrikciós endonukleáz Xbal és Xhol között helyezkedik el és a DNS replikációhoz, valamint a plazmádnak a sejtben való fenntartásához szükséges tarto5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
