202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 mányt és az ampicillin- rezisztenciát kölcsönző ß-laktamáz teljes génjét tartalmazza, a pBR322 plazmidból származtatható le [Bolivár et al.: Gene 2, 95-113 (1977) ; Sutcliffe, (supra)]. A plazmid maradék része hordozza a Pn25*/0 szabályozható promotor/operátor elemet (Stüber és tsai, supra), amelyet az EcoRI/Bam- HI fragmens részét képező RBSII.Sphl riboszómás kötési hely, az egér AT-3000 sejtvonal dihidrofolát reduktázt kódoló tartomány [Chang et al.: Nature 275, 617-624 (1978); Masters et al.: Gene 21, 59-63 (1983)], az Escherichia coli fág Lambda [Schwarz et al.: Nature 272, 410-414 (1978)] terminátor to, a klóramfenikol acetil-transzferáz promotormentes génje [Marcoli et al.: FEBS Letters 110, 11-14 (1980)] és az Escherichia coli rmB operon terminátor Tl-e [Brosius et al.: J. Mól. Bioi. 148, 107-127 (1981)] követ. C. pDMl,l plazmid A plazmid pDMI,l (4. ábra) hordozza a kanamicinrezisztenciát kölcsönző, transzpozon Tn5-ből származó neomicin foszfotranszferáz gént [Beck et al.: Gene 19, 327-336 (1982)] és a lac-represszort promoter mutáció Iq-val [Calos, Nature 274, 762-765 (1978)] kódoló lacl gént [Farabaugh: Nature 274, 765-769 (1978) ]. Ezenkívül a pDMI.l tartalmazza a pACYC184 plazmidot [Chang et al.: J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)], amely az E.coliban való replikációhoz és stabil fenntartásához szükséges információt hordozza. 2. példa IFN-y-t kódoló pGLS plazmid felépítése A. Elvek Kémiailag szintetizált oligonukleotidok felhasználásával az IFN-y-gént az RBSII.Sphl (6. ábra) riboszómás kötődési helyéhez adaptáljuk. Az IFN-y-t kódoló ffagmenst izoláljuk és pDS8/RBSÜ,SphI-ba beillesztve pGLS-plazmidot hozunk létre (7. ábra). B. Szintetikus oligonukleotid fragmensek szintézise, az IFN-y-gént az RBSU,SphI-hez adaptálva A szintetikus oligonukleotid ffagmenseket a 6. ábrán tüntetjük fel. Az oligonukleotid ffagmenseket egyidejűleg multiszintetizátoron készítjük el, az 1986. május 21-én kinyomtatott Al 181 491 sz. európai szabadalmi bejelentésben leírt módon, hordozóanyagként szabályozott pórusú üveget (CPG) alkalmazva [Kiefer et al.: Immunoi. Meth. 3, 69-83 (1985); Sproat et al.: Tetrahedr. Lett. 24, 5771-5774 (1983); Adams et al.: J. Am. Chem. Soc. 105, 661-663 (1983)]. A liofllizált oligonukleotidokat vízben egy óra alatt 4 ‘C-on oldjuk, a DNS koncentráció 100 nmól/ml. Minden oligonukleotidból 150 pmólt 1 1 (32P)-ATP (2 pmól, 5000 Ci/mmől), 1 egység T4-polinukleotid kináz (Gibco-BRL, Bázel) segítségével, 10 pl 5 mmólos trisz-HCl-ben (pH 8,5; 10 mmól magnézium-klorid) 10 percen át 37 ‘C-on kezelünk. Az összes reakciót 1 pl 5 mmőlos ATP hozzáadásával segítjük elő. A reakciókat oly módon állítjuk le, hogy a mintákat 7 perecen át 65 ’C-on hevítjük. C. IFN-y kódoló 1 fragmens felépítése és izolálása 4 pg PRC23/IFI-900 plazmidot (1984. január 25-én kinyomtatott A2 99 084 sz. európai szabadalmi bejelentés) 400 pg/ml DNS-koncentráció mellett 10 egység Ndel-gyel emésztünk, BRL „magpufferben” (50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM MgCh, 50 mM NaCl), gyártó cég: Gibco-BRL, Bázel, 37 'C-on 1 órán át, 20 pl össztérfogatban. A DNS-t emésztés után fenollal egyszer extraháljuk, etanollal kicsapjuk és a pelletet Speed-vac koncentrátorban 2 percen át szárítjuk. A pelletet T4-H- gáz pufferben oldjuk (50 mM Tris/HCl pH 7,8,10 mM MgCb, 10 mM DTT, 500 pM ATP). A SphI-Ndel adapter 1-et (6. ábra) tartalmazó foszforilezett oligonukleotideket (25 pmól) 1-szer ligáz pufferben 25 pl végső térfogathoz adunk. A ligálást 22 ’C-on 3 órán át végezzük, 1 pl DNS-ligáz (1 Weiss-egység, Boehringer, Mannheim) felhasználásával. A ligálást oly módon állítjuk le, hogy a mintát 7 percen át 65 'C-on inkubáljuk. A DNS-t etanollal lecsapjuk, a fenti módon szárítjuk, majd 50 pl Ncol emésztéses pufferben (50 mM Tris- HCl, pH 8, 10 mM MgCb, 50 mM NaCl, 50 mM KC1) újraszuszpendáljuk. Ezután 10 egység Ncol-t (BRLGibco, Bázel) adunk hozzá és a mintákat 1 órán át 37°C-on inkubáljuk. A restrikciós enzimet oly módon inaktiváljuk, hogy a mintát 7 percen át 65 °C-on melegítjük. Fenolos extrakció után a DNS-t a fenti módon kicsapjuk és szárítjuk. A pelletet 20 pl Klenow-pufferben oldjuk (50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM MgS04, 100 pM DTT), majd dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és dTTP- t adunk hozzá 100 pmól végső koncentrációban (ös$zreakciótérfogat: 30 pl). Ezután Klenow-enzimet (1 egység, Boehringer Hannheim) adunk hozzá és a mintát 1 órán át 22 °C-on inkubáljuk. A reakciót 2 pl 0,25 mólos EDTA hozzáadásával leállítjuk. Az elegyet fenollal egyszer extraháljuk és a DNS-t a fenti módon lecsapjuk, majd SphI-emésztési pufferben (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM 2-merkapto-etanol) újraszuszpendáljuk. 10 egység Sphl (BRLGibco, Bázel) hozzáadása után a mintát 1 órán át 37 °C- on inkubáljuk. Az emésztést oly módon állítjuk le, hogy a mintát 7 percen át 65 °C-on melegítjük, majd fenollal egyszer extraháljuk. A DNS-t a fentiek szerint lecsapjuk és szárítjuk. A DNS-pelletet 10 pl géltartalmú pufferben oldjuk. Ez 30 tömeg/térfogat % szacharózt, 0,1-0,1 tömeg/térfogat % brómfenol kéket, orange G-t és xilol cianol FF-t, valamint 25 mM EDTA-t és 0,1 tömeg/térfogat % SDS-t tartalmaz. A DNS-ffagmenseket 0,5-szőr trisacetát-puffert (40 mM Tris-HCl, 20 mM nátrium-acetát, 2 mM EDTA, pH 7,8) tartalmazó 6 %-os poliakrilamid-gélen elektroforézis segítségével elválasztjuk. A sávokat etidium-bromiddal (0,5 pl/ml) történő színezés után 300 nm UV-fényben láthatóvá tesszük. Az IFN-y-gént kódoló DNS-sávot a gélből szike segítségével kivágjuk. DNS markerként HaelII (Gibco-BRL, Bázel) segítségével emésztett 0X fágot alkalmazunk. A géldarabot ezután TBE-puffert (90 mM tris-borát, 90 mM bórsav, 3 mM EDTA, pH 8,3) tartalmazó 0.7%-os agaróz gélben 4 • 4 mm-es mélyedésekbe visszük át. A mélyedéseket homogén elektromos tér 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
