202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására

1

HU 202 919 B

2

szekvenciáját adva hozzá, amely a természetben jelen Az alkalmazott technika azonos azzal, amelyet fen

van az első Lys-Arg dublettől „felfelé” (2. és 16. áb- tebb leírtunk az alkalmazott oligonukleotidok kivéte ra). lével, amelyek szekvenciája a következő:

26-mer 15-mer

5’-AGCTTCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGACTGCACAG

AGAAACCTATTTTCTTAATGCATATGTCTGACGTGTCTTA

40-mer

A hasítási területnél az aminosavszekvenciát a 16. IRODALMI HIVATKOZÁSOK

ábra mutatja be. A megfelelő plazmidot pTG1818-nak 1. BAGDY D., BARABÁS E., GRÁF L., PETER- neveztük, és ez csupán abban különbözik a pTG1805- SEN T.E. és MAGNUSSON S.: Methods in Enzitől, hogy a Ser-Leu-Asp kodonoknak megfelelő 5’TTG GAT AAA nukleotidok vannak beleiktatva.

ATGYlsp4/pTG1818 tenyészet felülúszóikban mért aktivitás, a mérésnél a már leírt standard körülményeket követve, mintegy 200 egység 10 ml tenyészetben, ez mintegy 100-szor nagyobb mennyiségnek felel meg, mint amelyet az előző példában találtunk. Meg kell jegyeznünk, hogy a mérést 10 ml nem koncentrált tenyésztő tápközegben hajthattuk végre.

Az előző két példában azt mutattuk be, hogy az új Lys-Arg hely hozzáadása közvetlenül az érett hirudin-szekvenciától „fölfelé” lehetővé teszi, hogy az aktív anyag kiszabaduljon a felülúszóba. Ezekben a példákban azonban, miközben a prekurzor hasítása végbemegy az első Lys-Arg helyen (a központtól távoleső helyen az érett szekvencia kezdetét tekintve), egy nehezebb, inaktív szennyezést is kapunk a tény észközegben, amely az NH2-terminális végnél kiterjesztett hirudin-láncnak felel meg. Ez különösen világosan mutatkozik a TGYlsp4/pTG1805 tenyészetek esetében, ahol az inaktív szennyeződés van túlsúlyban. Ez megmarad valószínűleg a TGYlsp4/pTG1818 tenyészetek esetében is, ahol ugyan az inaktív komponens nincs túlsúlyban, de jelen lehet, amint ezt mások is leírták az EGF esetében (14). Hogy elkerüljük az inaktív anyag szintézise által képviselt kitermelési veszteséget, elhatároztuk, hogy olyan prekurzor szintéziséhez vezető új konstrukció megalkotásához fogunk hozzá, amely csupán abban különbözik a TGYlsp4/pTG897 sejtek által szintetizált konstrukciótól, hogy hiányzik belőle a Glu Ala Glu Alá szekvencia a Lys-Arg hasítási hely és az érett hirudinszekvencia első aminosava között.

A következő törzseket helyeztük el az Institut Pasteur (28 rue du Docteur-Roux, PARIS 15-eme) Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) törzsgyűjteményében 1985. április 30-án:

TGYlsp4/pTG1818: Saccharomyces cerevisiae, TGYlsp4(MATawra 3-251-373-328-te 3-11-15), ura+-szá transzformálva pTG1818 plazmiddal; ez az I

441 számot kapta.

TGYlsp4/pTG886: Saccharomyces cerevisiae,

TGYlsp4 (MATawrű 3-251-373-328-his 3-11-15), ura+-szá transzformálva pTG886 plazmiddal; ez az I

442 számot kapta.

15 mology, B. rész, 45. kötet, 669-678 oldal (1976).

2. MARKWARDT F.: Methods in Enzimology (szerkesztette: Perlman G.E. és Lorand L„ Academic Press) 19. kötet, 924-932 oldal (1970).

3. MARKWARDT F., HAUPTMANN I, NOWAK

20 G., KLESSEN Ch. és WALSMANN P.: Thromb.

Hemostatis (Stuttgart) 47, 226-229 (1982).

4. WALSMANN P. és MARKWARDT F.: Die Pharmazie 10, 653-660 (1981).

5. KLOSS Th. és MOTMANN U.: Longenbecks

25 Arch. Chirurg. 359, 548 (1982).

6. ISHIKAWA A., HAFTER R., SEEMULLER U., GOKEL J.M. és GRAEFF M.: Thrombosis Research 19, 351-358 (1980).

7. MARKWARDT F., NOWAK G., STURZEBEC-30 KER J„ GREISBADI U., WALSMANN P. és VOGEL G.: Thromb. Hemostasis (Stuttgart) 52, 160— 163 (1984).

8. NOWAK C. és MARKWARDT F.: Expt. Path. 18, 438-443 (1980).

35 9. SUTOR A.H., KNOP S. és ADLER D.: Kontrolle Antithrombocita; 23ste Symp. Blutgerinnung. Hamburg, 117-123. oldal (1981).

10. PETERSEN T.E., ROBERTS H.R., SOTTRUPJENSEN L., MAGNUSSON S. és BAGDY D.:

40 Protides Biol. Fluids; Proc Colloq. 23. kötet, 145— 149. oldal (1976).

11. CHANG J.Y.: FEBS Lett. 164, 307-313 (1983).

12. BASKOVA I.P., CHERKESOVA D.U. és MOSOLOV V.V.: Thromb. Res. 30. 459-476 (1983).

45 13. BUSSEY H., SAVILLE D., GREENE D. és munkatársai: Mol. Cell. Biol. 3, 1367-1370 (1983).

14. BRAKE A.J., MERRYWEATHER J.P., COIT D.G., HEBERLEIN U.A., MARIARZ F.R., MULLENBACH G.T., URDEA M.S., VALENZUELA

50 P. és BARR P.J.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 4641-4646 (1984).

15. BITTER G.A., CHEN K.K., BANKS A.R. és LAI P.H.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 5330-5334 (1984).

55 16. KURJAN J. és HERSKOWITZ L: Cell 30, 933- 943 (1982).

17. BEGGS J.: Genetic Engineering 2, 175-203 (1981).

18. BACH M.L., LACROUTE F. és BOTSTEIN D.:

60 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 386-390 (1979).

10