202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202 919 B 2 19. HITZEMAN R.A., HAGIE E.F., HAYFFLICK J.S. és munkatársai: Nucleic Acids Res. 10,7791-7808 (1982). 20. ITO H., FUKUDA Y., MURATA K. és KIMURA A.: J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983). 21. LAEMMLI V.K.C.: Nature 227, 680-685 (1970). 22. KRAMER W„ DRUTSA V., JANSEN H.W. és munkatársai: Nucleic Acids Res. 12, 9441-9556 (1984). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás-Str - Lex - ScL - H gén - szekvenciával rendelkező funkcionális DNS-szakasz előállítására, ahol H gén jelentése a hirudin génje vagy annak egy variánsa, ScL jelentése egy hasítási helyet kódoló DNS-szekvencia, Lex jelentése a gén-termék kiválasztás eléréséhez szükséges vezető szekvencia, Str jelentése egy olyan DNS-szekvencia, amely a H gén élesztőkben történő átírásához szükséges jeleket tartalmazza, és az -ScL-H gén- szakasz többször ismétlődhet, azzal jellemezve, hogy a H gént vagy valamely variánsát élesztő/E. coli ingázó vektorba iktatjuk be. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Lex szekvenciaként élesztő a szex feromon szekvenciát használunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ScL szekvenciaként a H gént a 3’ végnél megelőző ATG kódont tartalmazó szekvenciát használunk. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Scl szekvenciaként két olyan kódont tartalmazó szekvenciát alkalmazunk, amelyek Lys-Arg-ot kódolnak a H gén előtt a 3’ végnél. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Scl szekvenciaként öt olyan kódont tartalmazó szekvenciát alkalmazunk, amelyek Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-ot kódolnak a 3’ végnél. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a H gént követőén egy élesztő terminátor szekvenciát iktatunk be. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztő terminátor szekvenciaként a PGK gén szekvenciáját alkalmazzuk. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás legalább az alábbi aminosavakat kódoló szekvenciát tartalmazó funkcionális szakasz előállítására 1 - Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tip Leu Gin Val Asp Gly Ser Met hirudin ...; 2 - Lys Aig Glu Ala Glu Ala hirudin ... 3 - Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg hirudin ... 4 - Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Leu Asp Lys Arg hirudin ... 5 - Lys Arg hirudin ..., azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-szakaszokat kapcsoljuk. 9. Eljárás a hirudinélesztők általi kiválasztásához szükséges elemeket tartalmazó plazmid előállítására, amely az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti funkcionális szakaszt és legalább egy, élesztőben működő replikációs origót és adott esetben egy szelekciós jellemzőt tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-szakaszokat kapcsoljuk. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy replikációs origóként a 2 p plazmid replikációs origóját alkalmazzuk. 11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti eljárás a szelekciós jellemzőt is tartalmazó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-szakaszokat kapcsoljuk. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciós jellemzőként URA3 gént alkalmazunk. 13. Eljárás hirudin struktúrgént tartalmazó élesztőtranszformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas élesztőt egy, a 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított plazmiddal transzformálunk. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztőtranszformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő Saccharomyces élesztőket transzformálunk. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Mata szex típusú Saccharomyces élesztőt transzformálunk. 16. A 13-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Saccharomyces cerevisiae törzset transzformálunk. 17. Eljárás hirudin előállítására, azzal jellemezve, hogy a 13-16. igénypontok bármelyike szerinti élesztőtranszformánst megfelelő tápközegben fermentáljuk, és a tápközegben termelt hirudint érett formában, vagy hirudin-prekuizor formájában kinyerjük, majd az utóbbit in vitro éretté alakítjuk. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hirudint a tápközegből nyerjük ki. 19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett hirudint valamely prekurzorból az ScL-nek megfelelő szekvencia kémiai vagy enzimes hasításával nyerjük ki. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett hirudint a prekurzor metionin helyénél végzett kémiai hasítással nyerjük ki. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett hirudint a prekurzor Lys-Aig vagy Ser-Leu-Asp-Lys-Arg szekvenciája után végzett enzimes hasítással nyerjük ki. 22. A 17-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor hasítása után kapott hirudint helyreállításnak (renaturálásnak) vetjük alá. 23. Eljárás gyógyszerkészítmények és diagnosztikumok előállítására, azzal jellemezve, hogy a 17. igénypont szerinti eljárással előállított hirudint vagy egy, a 13. igénypont szerinti eljárással előállított élesztőt a gyógyszerkészítésben szokásos hordozóanyagokkal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
