202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202 919 B 2 követi a helyreállítás (renaturálás) olyan ismert módszerrel, [M.E. Winkler, M. Blaber, G.L. Bennett, W. Holmes and C.A. Vehar: Perification characterication of recombinant motivate from E. Coli, Bio/Technology 3, 993-1000, (1985)]. Összefoglalva az eljárást, a liofilezett peptideket feloldjuk 400 pl 5 mól/l-es guanidium-kloridban (GuHCl), amely 250 mmól/1 trisz«HCl-ben volt oldva, pH 9,0; az oldatot azután redukált glutationra nézve 2 nunól/l-essé, oxidált glutationra nézve 0,2 mmól/1- essé tettük 2,0 ml végső térfogatban (a végső koncentráció 1,0 mól/1 GuHCl és 50 mmól/1 trisz). 16 órás, 23 °C hőmérsékleten, sötétben végzett inkubálás után a mintákat dializáltuk 24 órán át 3*2 liter 50 mmól/1 trisz*HCl-t (pH 7,5/ és 50 mmól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal szemben 23 ’C hőmérsékleten, és a végső dializátumot centrifugálással derítettük. Ekkor megmértük a felülúszók trombinellenes aktivitását. Ennek a kísérletnek az eredményei, amelyeket az I. táblázatban mutatunk be, világosan megmutatják, hogy a pTG886 plazmiddal fertőzött sejtek felülúszóiban a trombinellenes aktivitás helyreállítása megtörtént, ugyanakkor nincs aktivitás a kontroll plazmidnál. I. TÁBLÁZAT AZ ÉLESZTŐTENYÉSZETEK FELÜLÚSZÓINAK TROMBINELLENES AKTIVITÁSA Plazmid A felülúszó kezelése Fajlagos Aktivitás, aktivitás, egység/ml egység/mg kiindulási fehérje pTG86 a. hasítás után, helyreállítás előtt <0,3 b. hasítás és helyreállítás után 2,46 102,5 Kontroll a. hasítás után, helyreállítás előtt <0,3 _ b. hasítás és helyreállítás után <0,15 <5,6 Amint látható, a rekombináns plazmidot kódoló élesztősejtek ki tudnak választani olyan pepiidet, amely a hasítási és helyreállítási reakció után a hirudin biológiai aktivitásával bír. Ez azt mutatja, hogy a többletaminosavak jelenléte az NH2-terminális végnél elegendő magyarázat a TGYlsp4/pTG886-ban jelen levő polipeptidek aktivitásának hiányára, és valószínűleg a TGYlsp4/pTG897 tenyészetek esetében is (Glu-Ala farok) ez a helyzet. 5. példa. Új hasítási hely bevezetése közvetlenül a HV-2 hirudint kódoló szekvencia első aminosava előtt - a pTG1805 plazmid A pTG897 konstrukcióban az a kockázati tényező, hogy a kiválasztott peptid megtartja Glu-Ala farkát az NH2 végen, amely megmagyarázná a trombinellenes aktivitás hiányát Ha ez a feltevés megfelel a valódi helyzetnek, lehetséges lenne az aktivitást közvetlenül a felülúszóból kinyerni úgy, hogy egy hasítási helyet hozzunk létre a Glu-Ala gyökök és a hirudin HV-2 első aminosava (izoluecin) között. Ezt úgy hajtottuk végre, hogy egy Lys-Arg dublettet kódoló szekvenciát adtunk hozzá, amely a feromon prekurzor érésében érdekelt endopeptidáz felismerő hely (2. ábra). A konstrukciót pontosan úgy kaptuk meg, ahogyan ezt a pTG897-nél leírtuk, azzal az eltéréssel, amely a két szintetikus oligonukleotidnál látható (14. ábra). Az így létrejött plazmidot pTG1805-nek neveztük. Ezt a plazmidot használtuk a TGYlsp4 törzs transzformálására, hogy ura+ típusú legyen. A felülúszóba kiválasztott anyagot gélelektroforézissel elemeztük, amint fentebb leírtuk, és összehasonlítottuk a TGYlsp4/pTG897-tel nyert anyaggal (15. ábra). Az alkalmazott törzsek;- 1. üreg: markerek, amelyek a 12. ábránál alkalmazott markerekkel azonosak;- 2. üreg: TGYlsp4, pTG897-tel transzformálva;- 3. üreg: TGYlsp4, pTG1805-tel transzformálva;- 4. üreg: kontroll, amely nem termel hirudint. A TGYlsp4/pTG1805 törzsre fajlagos polipeptidek lassabban vándoroltak, mint azok a polipeptidek, amelyek a TGYlsp4/pTG897 törzsre fajlagosak. Ez az eredmény azt sugallja, hogy az új hasítási helyet a megfelelő endopeptidáz nem használja hatásosan. A hirudin biológiai aktivitására a felülúszóban végzett vizsgálat azonban azt mutatta, hogy ennek az anyagnak egy kis része aktív, ellentétben azzal az anyaggal, amelyet a TGYlsp4/TpTG897 tenyészeteiből kaptunk, ahol az anyag világosan inaktív. II. TÁBLÁZAT ÉLESZTŐTENYÉSZETEK (10 ml) FELÜLÚSZÓINAK TROMBINELLENES AKTIVITÁSA Plazmid Fajlagos aktivitás Teljes aktivitás egység/mg egység (10 ml) pTG856 nem mutatható ki — pTG897 nem mutatható ki pTG1805 21- 2,0 6. példa. Új konstrukció, amely új, hatásosabb hasítási helyet foglal magában, amely lehetővé teszi az érett hirudin felszabadítását A fenti konstrukcióban (pTG897) a hirudin-aktivitásnak csak kis mennyiségét kaptuk meg a felülúszóban, valószínűleg azért, mert az érett hirudin felszabadítására tervezett második hasítási hely nem ismétlődött fel hatásosan. Ezért új konstrukciót hoztunk létre, amelyet úgy terveztünk, hogy a hozzáadott hasítási helyet az endopeptidáz számára érzékenyebbé tegyük, „felfelé” a Ser Leu Asp három aminosav 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
