202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202 919 B 2 Az elektroforézis-mintákat, amelyeket a 12. és 13. ábrákon mutatunk be, a következőképpen készítjük el. A 12. ábrához az extraktumokat a következő módon készítettük: 10 ml minimál tápközeget [Difco Yeast Nitrogen Base, aminosav nélkül (6,7 g/1) és glükóz (10 g/1), 0,5 % kazaminosavval (hidrolizált kazein) kiegészítve] beoltottunk különböző törzsekkel, és 20 órán át tenyésztettünk (stacioner fázis). A sejteket azután centrifugáltuk és a felülúszót vízzel szemben dializáltuk (retenciós minimum: 1000 molekulatömeg), majd centrifugálással szárítottuk vákuumban. A mintákat azután felvettük 50 |il ráterhelő pufferban, húsz mintát úgy kezeltünk, ahogyan ezt fentebb leírtuk, és akrilamid-SDS gélre (15 % akrilamid, 0,1 % SDS) vittük fel (21). Az alkalmazott törzsek:- 2. üreg: TGYlsp4 olyan plazmiddal transzformálva, amely nem tartalmazza a hirudinszekvenciát;- 3. üreg: TGYlsp4, pTG886-tal transzformálva;- 4. üreg: TGYlsp4, pTG897-tel transzformálva;- 1. üreg: Az 1. üregben a referencia-markert helyeztük el (Pharmacia LMW készlet; felülről lefelé: 94 000, 67 000, 43 000, 30 000, 20 100, 14 000). A csíkokat Coomassie kék R-250-nel végzett festéssel tettük láthatóvá. A 13. ábrához az extraktumokat a következő módon készítettük: 100 ml minimál táptalajt (+40 p/ml hisztidin) beoltottunk különböző törzsekkel egy éjszakán át végzett tenyésztéshez. Amikor a sejt sűrűsége elérte a mintegy 5* 106 értéket (exponenciális növekedési fázis), 40 pl S ciszteint (9,8 mCi/ml; 1,015 Ci/mmól) adtunk minden egyes tenyészethez. 10 perc múlva a sejteket centrifugáltuk, felvettük 10 ml teljes tápközegben (30°C) és 30°C hőmérsékleten inkubáltuk keverés mellett. 3 óra múlva a felülúszó 10 ml-ét dializáltuk vízzel szemben, és 0,5 ml térfogatra koncentráltuk, amint ezt a 12. ábránál leírtuk. Mintegy 35 000 cpm-et (40 pl) helyeztünk akrilamid-SDS gélre (15 % akrilamid, 0,1 % SDS). A fehérjecsíkok fluorográfía után láthatóvá váltak. Az alkalmazott törzsek:- 2. üreg: TGYlsp4 olyan plazmiddal transzformálva, amely nem tartalmazza a hirudinszekvenciát.- 3. üreg: TGYlsp4, pTG886-tal transzformálva;- 4. üreg: TGYlsp4, pTG897-tel transzformálva;- 1. üreg: az 1. üregbe a 13. ábrán jelzett molekulatömegű (• 103) markereket helyeztük. Amikor az ezeket a polipeptideket tartalmazó felülúszókat vizsgáltuk trombinellenes aktivitásra, aktivitást nem tudtunk kimutatni. A TGYlsp4/pTG886 által kiválasztott polipeptid várhatóan az a-feromon prekurzor hasításának normális lépésein megy keresztül, amely olyan hirudinmolekulát ad, amely NH2 terminális végénél 8 aminosavval ki van bővítve. Ezért nem meglepő, hogy a TGYlsp4/pTG886 sejtek által kiválasztott polipeptidek nem aktívak. Ezzel ellentétben a TGYlsp4/pTG897 által kiválasztott polipeptid esetében az lenne várható, hogy ez a polipeptid azonos legyen a természetes fehérjével, és ezáltal aktív legyen. Számos feltevés magyarázhatja az aktivitás hiányát: 1. A fehérje érése nem teljes, és valószínűleg maradnak Glu-Ala gyökök az NH2 végnél, amint azt EGF-nél felhám növekedési faktor (14). 2. A fehérje azért inaktív, mert nem rendelkezik a korrekt konformációval, vagy egy másik elképzelés szerint azért, mert a tenyészet felülúszóban olyan fehérjék vagy 1000 molekulatömegű molekulák vannak, amelyek gátolják az aktivitást. 3. A fehérje nem teljes, mivel intracelluláris és/vagy extracelluláris proteolizisen ment keresztül. 4. példa. Aktiválás cianogén-bromiddal végzett hasítással Ha az aktivitás hiányát az NH2 terminális végnél levő többlet aminosavak jelenléte okozta az aktivitást helyreállíthatjuk olyan módon, hogy a TGYlsp4/pTG886 által kiválasztott pepiidet cianogénbromiddal hasítjuk. Ez a reagens a metionin gyökökre fajlagos, és a pTG886 által kódolt fúziós fehérje csak egyetlen metionint tartalmaz. Ezt a reakciót a következő módon hajtottuk végre: vagy a pTG886 plazmidot, vagy egy hirudin beiktatást nem tartalmazó kontroll plazmidot tartalmazó élesztőt tenyésztettünk 10 ml tápközegben 24 órán át. Ebben az időpontban a tenyészet elérte a 7-10*107 sejt • ml'1 sűrűséget. A felülúszót elkülönítettük a sejttől, intenzíven dializáltuk desztillált vízzel szemben, majd liofileztük. A száraz port 1 ml 70 % erősségű hangyasavban feloldottuk és egy alikvotot használtunk fel a teljes fehérjetartalom meghatározására (a Coomassie kékkel, a Biorad által forgalmazott reagenssel végzett festés módszerével); a készítmény maradékát 1 ml friss cianogén-bromid oldattal kezeltük (30 mg/ml) 70 % erősségű hangyasavban. Az oxigént nitrogénárammal eltávolítottuk, majd a csöveket sötétben inkubáltuk 4 órán át szobahőmérsékleten. Minden manipulációt, amelyet cianogén-bromid jelenlétében hajtottunk végre, megfelelő óvintézkedések mellett és füstkamrában végeztünk. A cianogén-bromiddal végzett hasítási reakciót 10 térfogat desztillált víz hozzáadásával állítottuk le, majd az oldatot liofileztük. Az elhasított peptideket újra feloldottuk 10 ml desztillált vízben, majd még kétszer újra liofileztük. Végül a peptideket kis térfogat desztillált vízben újra feloldottuk, és egy alikvotot alkalmaztunk, hogy megmérjük a trombinellenes aktivitást. A minta maradékát liofileztük és az alább leírt helyreállítási (renaturáló) lépéseknek vetettük alá. Mivel a hirudinaktivitás függ a diszulfidhidak jelenlététől a molekulában (1), valószínűnek tűnik, hogy a cianogén-bromiddal hasított pepiidet korrekt módon helyre kell állítani abból a célból, hogy biológiai aktivitást mutasson. A hasított peptideket ezért denaturálásnak kell alávetni 5 mól/l-es guanidin»HCl-ben, ezt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
